И 4400-87 Инструкция по определению витамина А и бета-каротина в пищевых продуктах

Утверждаю

Заместитель Начальника Главного

санитарно-эпидемиологического

управления Минздрава СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

10 июля 1987 г. N 4400-87

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВИТАМИНА A И БЕТА-КАРОТИНА

В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Разработана в Институте питания АМН СССР лабораторией витаминизации пищевых продуктов.

Колориметрический метод определения витамина A с треххлористой сурьмой широко используется для определения содержания витамина A в пищевых продуктах как в нашей стране, так и за рубежом. Для определения содержания бета-каротина (провитамина A) применяют спектрофотометрический метод после отделения его от каротиноидов на окиси алюминия или других адсорбентах.

Методы прошли широкую апробацию в различных лабораториях, отраслевых институтах пищевой промышленности и кафедр гигиены и питания медицинских институтов, одобрены Минздравом СССР и рекомендованы для практического использования Междуведомственной комиссией по составлению таблиц "Химический состав пищевых продуктов".

Принцип метода определения витамина A. Метод основан на реакции витамина A с треххлористой сурьмой в хлороформе с образованием синей окраски, интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию витамина A. Предварительно проводят щелочной гидролиз жира, экстракцию витамина A органическим растворителем и отделение его от других соединений с помощью адсорбционной хроматографии.

Принцип метода определения бета-каротина. Метод основан на измерении интенсивности светопоглощения растворов бета-каротина. Как соединения с сопряженными двойными связями каротиноиды имеют характерные спектры поглощения в видимой области. Бета-каротины экстрагируют органическим растворителем, отделяют от других каротиноидов с помощью адсорбционной хроматографии и измеряют поглощение его растворов на спектрофотометре при 450 - 452 нм.

При анализе молока, мяса, рыбы и блюд из них, приготовляемых без добавления растительных продуктов, возможно определение витамина A и бета-каротина из одного экстракта после их разделения на одной колонке с окисью алюминия. При анализе продукта, состоящего из животного и растительного сырья, определение витамина A и бета-каротина возможно из одного экстракта, но после выделения этих соединений на разных колонках.

Оборудование. Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, поверочной ценой деления не более 0,5 мг; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г, поверочной ценой деления не более 50 мг; роторный испаритель; водяная баня с закрытым электрическим обогревом; фотоэлектроколориметр; спектрофотометр; гомогенизатор; шкаф сушильный.

Посуда. Ступка с пестиком; воронки фильтровальные 3; 5 - 7,5 см; воронки делительные вместимостью 250 - 500 куб. см; колбы мерные вместимостью 50 и 100 куб. см; колбы конические вместимостью 100 и 250 куб. см; колбы круглодонные вместимостью 50, 100, 250, 500 куб. см со шлифом 14,5 и 29 мм; холодильник обратный, водяной со шлифом 14,5 мм; хроматографическая колонка - стеклянная трубка длиной 9 - 11 см, внутренний диаметр 10 мл, в нижний конец колонки впаяна трубка с внутренним диаметром 5 - 6 мм, постепенно суживающаяся до 1,5 - 2,0 мм, колонка заканчивается отводом для создания разрежения и шлифом 14,5; пробирки со шлифом 14,5, градуированные на 5, 10, 15 куб. см; пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 куб. см; микропипетки градуированные на 0,1 и 0,2 куб. см; цилиндры мерные на 50, 100, 200 куб. см; стаканы на 50, 100, 250 куб. см.

Реактивы. Ретинола ацетат (Госфармакопея СССР, 10 изд., ст. 578); аскорбиновая кислота (Госфармакопея СССР, 10 изд., ст. 6); алюминия окись по Брокману II, нейтральная; калия гидроокись; натрий сернокислый безводный; сурьма треххлористая; фенолфталеин; ацетон; гексан; спирт этиловый ректификованный; уксусный ангидрид; хлороформ; эфир этиловый; бумага фильтровальная. При работе с эфиром, ацетоном, гексаном, хлороформом соблюдать правила техники безопасности с органическими растворителями.

Приготовление реактивов.

1. Стандартные растворы ретинола ацетата с массовой концентрацией 2900 МЕ/куб. см и 58 МЕ/куб. см. Растворяют 0,1000 г ретинола ацетата в мерной колбе на 100 куб. см в хлороформе и доводят хлороформом до метки (раствор с массовой концентрацией 2900 МЕ/куб. см). Для приготовления раствора 58 МЕ/куб. см 1 куб. см раствора с концентрацией 2900 МЕ/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см и доводят до метки хлороформом. Соединения ретинола ацетата очень неустойчивы к кислороду воздуха и свету, поэтому растворы готовят сразу при вскрытии ампулы и в день построения калибровочного графика.

   2. Раствор  треххлористой сурьмы (реагент Карр-Прайса). Отвешивают 20 г

SbCl  в конической колбе вместимостью 250 куб. см, в которую предварительно

отмерено 100 куб. см хлороформа (в случае большой навески после взвешивания

добавляют  необходимое  количество  хлороформа) и растворяют при слабом (не

выше  40  °C)  нагревании на водяной бане, периодически встряхивая. Раствор

охлаждают,  добавляют  2  -  3  куб.  см  уксусного ангидрида, колбу плотно

закрывают  и  оставляют  на  ночь для отстаивания. Затем прозрачный раствор

осторожно  сливают  в  темную склянку с плотно закрывающейся крышкой. SbCl

                                                                         3

токсична  и  коррозионна,  необходимо  защищать  от  попадания кожу, глаза,

дыхательные пути.

3. Раствор гидроокиси калия 50%. 50 г KOH растворяют в 50 куб. см дистиллированной воды.

4. Окись алюминия. Для приготовления окиси алюминия определенной степени активности отвешивают в бюксе 6 г адсорбента и ставят в сушильный шкаф (t = 160 - 180 °C) на 60 - 90 мин. Затем окись алюминия дезактивируют, быстро добавляя воду микропипеткой с массовой долей 1% (0,06 куб. см) или 3% (0,18 куб. см). Бюкс закрывают крышкой и встряхивают до тех пор, пока масса не станет однородной. Подготавливают адсорбент и заполняют им колонку перед нанесением на нее исследуемого раствора.

5. Растворы ацетона в гексане 4; 4; 10, 15% (объем/объем).

6. Раствор фенолфталеина (спиртовый) с массовой концентрацией 1%.

Ход определения.

1. Щелочной гидролиз. Интервал определяемых массовых концентраций витамина A составляет 1,5 - 10 МЕ (0,4 - 3,0 мкг)/куб. см хлороформного экстракта, используемого для реакции с треххлористой сурьмой. Массу навески продукта и последующее разведение рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций. Масса навески продукта должна находиться в диапазоне 1 - 20 г с массовой концентрацией витамина A 2 - 20 мкг.

Массу образца помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 или 250 куб. см, соединенную шлифом с обратным водяным холодильником, добавляют 40 - 60 куб. см этилового спирта 0,1 - 0,2 г аскорбиновой кислоты и 50% раствор KOH. Доля добавляемого раствора KOH зависит от вида продукта и от массовой доли и состава в нем жира. При анализе продукта с низкой массовой долей жира (менее 6%) и витамина A (мясо, рыба и готовые блюда из них) на 10 г массы образца добавляют 2 - 4 куб. мм раствора KOH. При более высокой массовой доли жира в этих продуктах на 10 г образца добавляют 6 - 10 куб. см раствора KOH. Для продуктов с более высокой массовой долей витамина A (яйцо, творог и готовые блюда из них) и жира > 10% на массу образца 5 - 7 г берут 5 - 7 куб. см щелочи. При анализе молока и молочных продуктов с низкой массовой долей жира и витамина A массу навески увеличивают до 20 г, щелочь добавляют 5 - 7 куб. см. Для продуктов с высокой массовой долей жира 30% и выше (сыры, масло сливочное и др.) на массу образца 3 - 5 г берут 4 - 8 куб. см щелочи.

После добавления щелочи смесь нагревают на водяной бане с обратным водяным холодильником при температуре кипения смеси в течение 30 мин. Затем смесь охлаждают и переливают в делительную воронку. В воронку добавляют воду, чтобы окончательная концентрация этилового спирта была около 30 - 35%. Признаком полного омыления служит то, что после добавления воды смесь остается прозрачной. При образовании мути увеличивают массовую долю щелочи при омылении.

2. Экстрагирование. Неомыляемый остаток экстрагируют этиловым эфиром 4 раза, сначала объемом эфира, равным объему добавленной воды, а затем объемами на 20% меньшими. Ополаскивают эфиром колбу после омыления. Объединенный эфирный экстракт отмывают от щелочи водой по фенолфталеину (при добавлении фенолфталеина промывная вода не должна окрашиваться). Экстракт фильтруют через слой безводного сернокислого натрия в круглодонную колбу роторного испарителя вместимостью 250 или 500 куб. см медленно, чтобы над сернокислым натрием не образовывался слой раствора, сернокислый натрий промывают эфиром. Затем эфир отгоняют под вакуумом, и неомыляемый остаток растворяют в 5 куб. см гексана.

   3. Хроматография.  В суконный конец хроматографической колонки помещают

капроновую  ткань, промытую  гексаном.  Затем непрерывной струей насыпают в

колонку  окись  алюминия  с  массовой  долей  воды  3%  (см. "Приготовление

реактивов"),   уплотняя  ее  легким  постукиванием  по  колонке  стеклянной

палочкой.  На  верх  адсорбента  добавляют  слой безводного сульфата натрия

(0,5 - 1,0 см).  Подготовленную  колонку  промывают  10 куб. см  гексана  и

наносят   5 куб.  см   испытуемого  экстракта.   Затем   снова   пропускают

10 куб. см  гексана  (фракция 1).  При  анализе  продуктов,  не  содержащих

растительные продукты  (молочные,  мясные и  т.д.) после гексана пропускают

через  колонку  раствор  ацетона в гексане с массовой  долей 4%, до тех пор

пока  элюат не станет бесцветным  (фракция 2).  В этом случае фракцию 1 и 2

объединяют,  выпаривают  под  вакуумом  на  роторном  испарителе,   остаток

растворяют в гексане  (5 - 10 куб. см) и в растворе определяют бета-каротин

(V ).

 1

   При  анализе  образца,  содержащего  продукты животного и растительного

происхождения, после  гексана  через  колонку  пропускают раствор ацетона в

гексане  с  массовой  концентрацией  10%  (30  куб. см). Витамин A элюируют

последующим  пропусканием  через  колонку  30  куб.  см  раствора ацетона в

гексане  с массовой концентрацией 15% (фракция 3). Пропускают раствор через

колонку  при  небольшом  разрешении  (2,5  - 3,0 куб. см/ мин.). Фракцию 3,

содержащую  витамин  A,  выпаривают  в  роторном  испарителе под вакуумом и

растворяют остаток в хлороформе (2 - 6 куб. см) (V ).

                                                 2

4. Определение витамина A.

1) Проведение определения. Вносят 0,4 куб. см хлороформного раствора витамина A в кювету, помещают ее в кюветодержатель фотоэлектроколориметра, добавляют 4 куб. см раствора треххлористой сурьмы и быстро измеряют оптическую плотность, так как окраска неустойчива и начинает исчезать через 5 - 6 сек. Измерение проводят при длине волны 620 нм. После измерения наблюдают за окраской раствора: синяя окраска должна исчезнуть и после этого раствор не должен быть окрашенным или мутным. Помутнение возможно в случае попадания воды с испытуемым раствором или с раствором сурьмы. Наличие окраски раствора через 15 с после проведения реакции свидетельствует о недостаточно полном отделении витамина A от мешающих соединений. В том и другом случае анализ необходимо повторить, учтя вышеуказанные замечания.

2) Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора ретинола ацетата с массовой концентрацией 58 МЕ/ куб. см готовят разведения с массовой концентрацией 1,2 МЕ/ куб. см (1 куб. см стандартного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см и доводят объем до метки хлороформом); 2,9 МЕ/ куб. см (0,5 куб. см стандартного раствора помещают в градуированную пробирку на 10 куб. см и доводят объем хлороформом до 10 куб. см); 5,8 МЕ/ куб. см (1 куб. см стандартного раствора помещают в градуированную пробирку на 10 куб. см и доводят объем хлороформом до 10 куб. см); 11,6 МЕ/куб. см (1 куб. см стандартного раствора помещают в градуированную пробирку на 5 куб. см и доводят объем хлороформом до 5 куб. см). Приготовленные растворы хорошо перемешивают. Из каждого разведения отбирают по 0,4 куб. см раствора и проводят колориметрическую реакцию так же, как при анализе испытуемых растворов. Для построения калибровочного графика по оси ординат откладывают полученные значения оптической плотности, а по оси абсцисс - соответствующие им количества витамина A в 1 куб. см раствора в МЕ.

   3) Расчет. Массовую долю витамина A в мг на 100 г продукта вычисляют по

формуле:

                                K x V  x 100

                                     2

                            X = ------------,                          (1)

                                  3300 x a

   где:

   K - массовая концентрация витамина A в 1 куб. см  испытуемого раствора,

определяемая по стандартной кривой, МЕ;

   V  - общий объем раствора в хлороформе, куб. см;

    2

   100 - пересчет на 100 г продукта;

   3300 - пересчет на МЕ в мг;

   a - масса образца, г.

Вычисление проводят до третьего десятичного знака. За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 15% от среднего арифметического значения.

5. Определение бета-каротина.

1) Экстрагирование каротина из растительного материала (свежие и сухие овощи, плоды, ягоды).

Интервал определяемых концентраций бета-каротина составляет 0,1 - 1 мкг/ куб. см раствора, оптическую плотность которого измеряют на спектрофотометре. Массу навески продукта (1 - 15 г с массовым содержанием бета-каротина 0,01 - 0,05 мг) и последующее разведение рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций.

   Массу  исследуемого образца, взятую из средней пробы переносят в ступку

или  стакан  смесителя,  добавляют  0,1  -  0,2  г  аскорбиновой  кислоты и

растирают с небольшим количеством измельченного стекла или гомогенизируют в

смеси ацетон-гексан (1:1). Затем смеси дают отстояться и сливают прозрачный

экстракт  в  делительную  воронку.  Экстракцию  повторяют  до тех пор, пока

раствор  не  станет бесцветным. Отмывают объединенный экстракт от ацетона 3

раза порциями воды, равными объему ацетона, использованного при экстракции.

Экстракт фильтруют через слой сернокислого безводного натрия в круглодонную

колбу  от  роторного испарителя вместимостью 250 или 500 куб. см медленно и

промывают  слой  сернокислого  натрия на фильтре 2 раза небольшими порциями

гексана.  Выпаривают гексан на роторном испарителе до объема 4 - 5 куб. см,

если  раствор  интенсивно  окрашен,  его  не  выпаривают  и  измеряют объем

раствора (V ).

          3

   2) Хроматография  бета-каротина  при  анализе  растительного  сырья.  В

хроматографическую  колонку  непрерывной  струей  насыпают окись алюминия с

массовой  долей  воды  1%,  уплотняя  ее  легким  постукиванием  по колонке

стеклянной   палочкой.   На   верх  адсорбента  добавляют  слой  безводного

сернокислого  натрия  высотой  0,5  -  1,0 см. Колонку промывают 10 куб. см

гексана  и  наносят 5 куб. см раствора бета-каротина в гексане, полученного

(раздел 2) при  анализе  продуктов  из  животного и растительного сырья или

раздел 5.1 (в дальнейшем необходимо следить, чтобы верхний слой колонки был

всегда  покрыт  раствором).  Каротиноиды на высоте  колонки  (сверху  вниз)

располагаются  в  следующем  порядке:  хлорофилл,  ксантофиллы,  ликопин  и

каротины (бета  и  альфа).  Альфа-  и  бета-каротины  из  всех каротиноидов

обладают  на  окиси  алюминия  наименьшей  адсорбционной  способностью и их

элюируют, пропуская  10 куб. см гексана или пропуская после гексана раствор

ацетата в гексане с массовой концентрацией 1% до тех пор, пока вытекающий с

колонки  раствор  не  станет  бесцветным.  После  элюции каротина с колонки

измеряют объем элюата (V ).

                       1

   3)   Спектрофотометрическое   определение  бета-каротина  и  расчет  на

спектрофотометре  определяют оптическую плотность растворов бета-каротина в

гексане,  полученных в разделах 3 и 5.2, при  длине волны  450  -  45 нм  и

                                                                    1%

рассчитывают содержание, используя коэффициент удельного поглощения E    .

                                                                    1 см

   Массовую  долю   бета-каротина  в  мг  на  100 г  продукта вычисляют по

формуле:

                             10 x Д x V  x 100

                                       1

                         X = -----------------,                        (2)

                                 1%

                                E     x a

                                 1 см

   где:

   10 - содержание каротина в 1 куб. см 1% раствора, мг;

   Д - оптическая плотность испытуемого раствора, куб. см;

   V  - объем элюата, куб. см;

    1

   100 - пересчет на 100 г продукта;

    1%

   E     = 2580;

    1 см

   a - навеска, г.

   При анализе растительного материала массовую долю бета-каротина в мг на

100 г продукта вычисляют по формуле:

                         10 x Д x V  x V  x 100

                                   1    3

                     X = ----------------------,                       (3)

                              1%

                             E     x 5 x a

                              1 см

   где:

   V  - общий объем испытуемого раствора, куб. см;

    3

   5 - объем раствора, нанесенный на колонку, куб. см;

остальные обозначения, что и к формуле (2).

Полноту отделения бета-каротина от ликопина проверяют путем снятия спектра при длинах волн 420 - 430 нм с интервалами 5 нм. Если полученные максимумы соответствуют максимуму поглощения для бета-каротина в гексане (450 - 451, 475 нм), то, следовательно, бета-каротин отделен от ликопина.

Вычисление проводят до третьего десятичного знака. За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 15% от среднего арифметического.