МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
Н А К А З 30.05.2007 № 284
Про затвердження методичних вказівок "Санітарно-вірусологічний контроль водних об'єктів"
Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідеміологічного благополуччя населення", з метою науково-методичного забезпечення державного санітарно-епідеміологічного нагляду НАКАЗУЮ:
1. Затвердити методичні вказівки "Санітарно-вірусологічний контроль водних об'єктів" (додаються).
2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду (Пономаренко А.М.) ці методичні вказівки довести до відома керівників установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.
3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренка А.М.
Перший заступник Міністра,
головний державний
санітарний лікар України С.П.Бережнов
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ Міністерства
охорони здоров'я України
30.05.2007 № 284
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
"Санітарно-вірусологічний контроль водних об'єктів"
1. Загальні положення
1.1. Методичні вказівки "Санітарно-вірусологічний контроль водних об'єктів" (далі - методичні вказівки) встановлюють єдині вимоги щодо організації відбору проб та виконання санітарно-вірусологічних досліджень води різного виду водокористування і ступеня забруднення по відношенню до її епідемічної безпеки за санітарно-вірусологічними показниками, у т.ч. питної води за показниками Державних санітарних правил і норм "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", затверджених наказом МОЗ України від 23.12.96 N 383, зареєстрованим в Мін'юсті України 15.04.97 за № 136/1940.
1.2. Методичні вказівки призначені для використання при здійсненні контролю якості води (питної, господарсько-побутового призначення, відкритих водойм, стічної, води для зрошення сільськогосподарських угідь тощо) за вірусологічними показниками під час проведення державного санітарно-епідеміологічного нагляду та можуть бути використані для проведення відомчого та всіх інших видів контролю, незалежно від підпорядкованості і форм власності лабораторій.
2. Терміни та їх визначення
У цих методичних вказівках застосовуються такі умовні скорочення:
АГ - антиген
АТ - антитіло
БТО - бляшкоутвірних одиниць
ВТС - вірусне транспортне середовище
ВГА та ВГЕ - вірус гепатиту А та вірус гепатиту Е
ГГМКК - гідрогель метилкремнієвої кислоти
ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота
ЕМ - електронна мікроскопія
ЕД - еритроцитарний діагностикум
ЕФ - електрофорез
ІЕМ - імунна електронна мікроскопія
ІАР - імунна асцитна рідина
ІФА - імуноферментний аналіз
ІХА - імунохроматографічний аналіз
ККІД - доза, інфікуюча в 50% культуру клітин
50/мкл
НВЧ - найбільш вірогідне число
НК - негативний контроль
НКЗ - негативний контрольний зразок
НПЕВ - неполіомієлітні ентеровіруси
НЦМ - нітроцелюльозна мембрана
МФА - метод флуоресціюючих антитіл
ПААГ - поліакриламідний гель
ПЕГ - поліетиленгліколь
ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція
ПК - позитивний контроль
ПКЗ - позитивний контрольний зразок
РВ - ротавірус
РЛА - реакція латексаглютинації
РН - реакція нейтралізації
РНГА - реакція непрямої гемаглютинації
РНК - рибонуклеїнова кислота
РотаАГ - ротавірусні антигени
РВІ - ротавірусна інфекція
ФП - фільтр Петрянова
ЦПД - цитопатична дія
ЦПД - мінімальна доза вірусу, що викликає цитопатичну
50/мл дію в 50% заражених клітинних культур
(клітинних моношарів)
3. Відбір проб для досліджень
Основними об'єктами санітарно-вірусологічного дослідження є:
- стічні води;
- стічні води на етапах очистки та знезаражування;
- вода відкритих водойм, що використовуються як джерела водопостачання;
- водопровідна вода;
- вода підземних джерел;
- питна вода у розвідній водопровідній мережі;
- вода питна доочищена;
- вода питна бутильована;
- вода морських і прісних водойм, що використовуються для рекреаційних потреб;
- вода плавальних басейнів та аквапарків.
Санітарно-вірусологічне дослідження водних об'єктів здійснюється під час проведення запобіжного та поточного державного санітарно-епідеміологічного нагляду, а також за епідемічними показаннями.
Санітарно-вірусологічне дослідження води складається з етапів:
- відбір проб для дослідження;
- підготовка проб для дослідження (первинна обробка матеріалу);
- концентрація вірусів у пробах води;
- деконтамінація вірусного концентрату;
- вірусологічне дослідження (виділення вірусу або виявлення його антигенів та фрагменту геному).
Відбір проб води здійснюють, дотримуючись загальних вимог, що забезпечують збереження вірусів у пробі та не допускають забруднення вторинною мікрофлорою. Проби відбирає проінструктований працівник лабораторії, який працює в медичному халаті (спецодязі) та латексних або гумових рукавичках. Після відбору проб рукавички обробляють 70% етиловим спиртом, по завершенню роботи - халати та рукавички підлягають стерилізації.
Одержаний матеріал маркують, заповнюють направлення на дослідження, зазначаючи місце (населений пункт), точку відбору, назву проби та дату (число, місяць, рік). Термін доставки матеріалу в лабораторію повинен не перевищувати 6 годин з моменту його відбору. Проби води доставляють у лабораторію, дотримуючись правил холодового ланцюга (з холодовими елементами в сумках - холодильниках, пластикових коробках тощо). Доставлений матеріал обробляють у лабораторії в перші години з моменту його надходження. Якщо не можливо провести дослідження в цей день, можна зберігати доставлені проби при температурі +4 +- 0,1 град. С впродовж доби. Кожну пробу обов'язково реєструють в робочому журналі.
3.1. Стічні води
Місцями відбору проб стічних вод є оглядові колодязі, відкриті частини колектора, а також очисні споруди до і після очистки. За умови поточного санітарного нагляду (систематичного вірусологічного контролю) за стічними водами проби відбирають 1-2 рази на місяць, у разі зміни епідемічної ситуації кратність взяття проб визначає епідеміолог.
Відбір проб стічної води здійснюють різними методами. Існують два принципово відмінних між собою способи відбору проб води. Перший спосіб можна визначити як "захват" (grab), а другий - як "засідка" чи "ловушка" (trap). При першому способі відбір проб води здійснюється одномоментно в певний проміжок часу у стерильний посуд. Проби у другий спосіб відбираються з попередньою адсорбцією вірусів безпосередньо у воді досліджуваного об'єкту. Такий спосіб відбору проб ще має назву адсорбційного і здійснюється за допомогою марлевих тампонів за Moore та пакетиків, що заповнені адсорбуючим матеріалом (з іонообмінними смолами, макропористим склом, активованим вугіллям, бентонітом тощо).
Вибір методу відбору залежить від можливостей вірусологічної лабораторії, умов транспортування та від того, наскільки цей метод є зручним для співробітників лабораторії в подальшій роботі.
Важливо враховувати доступність та необхідну стандартизацію адсорбенту!
Відбір проб за допомогою марлевих тампонів
Проби стічної води можна відбирати за допомогою марлевих тампонів за Moore: нарізають марлю на серветки, розміром 10 х 10 см, кладуть їх одну на одну пошарово в 48 шарів, пронизують через них капронову шворку або нитку і міцно фіксують усі шари марлі, запаковують тампон у папір, стерилізують, лишаючи кінець шворки в 1,5 м ззовні. У місці відбору проб фіксують вільний кінець шворки на дроті, що закріплений над колектором, знімають обгортку і занурюють тампон на 1-2 доби в потік стічних вод. Після експозиції тампони витягують, переносять в стерильний поліетиленовий мішечок чи в стерильну скляну банку та щільно (герметично) закривають.
Недоліком відбору проб за допомогою марлевих тампонів є неможливість забезпечити необхідну стандартизацію адсорбенту.
Проте метод надзвичайно простий, доступний та економічний.
Відбір проб стічних вод в посуд
Відбір проб води способом "захват" одномоментно є більш перспективним і надійним способом, регламентованим ВООЗ в рекомендаціях щодо нагляду за поліовірусом в об'єктах довкілля.
Пробу із загального потоку стічних вод можна відбирати вручну за допомогою спеціального пристрою (батометру) у стерильний скляний посуд об'ємом 1,0 л (наприклад, дуже зручно відбирати у стерильні скляні пляшки об'ємом 500 мл з-під поживних середовищ для культури клітин) або матраци для культури клітин, об'ємом 1,0-1,5 л, які заповнюють на дві третини.
Сучасні очисні споруди оснащені автоматичними пристроями для відбору проб води у скляний посуд з чітко фіксованим інтервалом часу впродовж доби. З отриманих у такий спосіб проб надалі слід готувати змішану пробу і використовувати її для дослідження.
Стерильний скляний посуд слід відкривати безпосередньо перед відбором проби води. Споласкувати посуд або торкатись будь-яких предметів пробкою або краями посуду забороняється!
3.2. Вода поверхневих та підземних водойм (моря, водосховища, штучні та природні водойми, озера, річки, артезіанські свердловини, криниці)
Дослідження води поверхневих та підземних водойм проводять переважно при виборі джерела для централізованого господарсько-питного водопостачання або для оцінки санітарного стану місць відпочинку (наприклад, пляжів) за епідеміологічними показниками.
При виборі поверхневих водойм як джерела централізованого водопостачання місця для відбору проб води намічають відповідно до ГОСТу 2761-84 "Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения".
При виборі підземних джерел водопостачання місця відбору проб намічають у відповідності з параграфом 3 того ж самого ГОСТу. Проби беруть 1-2 рази на місяць або за схемами, що розробляє санепідслужба з урахуванням санітарно-гігієнічної та епідемічної ситуації.
Відбір проб безпосередньо з берега річки або озера не бажаний.
Воду з відкритих водойм, криниць, калтажів тощо забирають вручну за допомогою батометра у стерильний посуд об'ємом 3 л. При відборі проб води поверхневих водойм використовують плавучі засоби, мости або помости. Проби відбирають з глибини 10-15 см від поверхні води, придонні проби - на рівні 30-50 см від дна. Об'єм однієї проби - 3 л.
Проби води підземних джерел (у тому числі артезіанських свердловин) відбирають після тривалого відкачування води до встановлення постійного динамічного рівня у стерильний посуд об'ємом 10 л. Це, як правило, відносно чиста вода, її використовують для водозбірних колонок та водопроводів, тобто це питна вода. Посуд наповнюють водою та щільно закривають стерильною гумовою пробкою або кришечкою.
3.3. Питна вода
Проби води централізованого водопроводу беруть для дослідження в розвідній водопровідній мережі відповідно вимогам Державних санітарних правил і норм "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", затверджених наказом МОЗ України від 23.12.96 N 383.
Питну воду відбирають безпосередньо в стерильний посуд без застосування гумових (латексних) шлангів, водорозподільчих сіток або насадок. Перед відбором проб кран кінцевої ділянки периферійної водопостачальної мережі (або відвідний кран на етапі обробки води на водозабірних спорудах) тричі фламбують запаленим спиртовим факелом і спускають воду впродовж 10-15 хв. при повністю відкритому крані.
Якщо через відповідний кран вода тече постійно, то відбір проб води проводиться без фламбування запаленим спиртовим факелом, без змін напору води або у самій конструкції крану.
Об'єм однієї проби - 10 л.
Для нейтралізації залишків хлору в посуд для відбору проб перед стерилізацією додають гіпосульфіт натрію з розрахунку 20 мг на 1 л води!
4. Підготовка проб до дослідження
4.1. Обробка проб стічних вод
Проби стічної води, відібрані за допомогою марлевих тампонів за Moore, обробляють за методом Ріордана. Для цього в поліетиленовий мішечок з тампоном додають 10 мл розчину Хенкса (рН 7,4), перемішують, декілька разів стискаючи мішечок ззовні, через 1-2 хв. тампон віджимають та викидають.
У віджатій рідині вимірюють рН та доводять до значень 8,0-8,4, використовуючи 1 М розчин NaOH або 1 М розчин HCl. Про значення рН судять за зміною кольору індикаторної смужки. Із загальної кількості віджатої рідини відбирають тільки 100 мл в стерильну широкогорлу центрифужну склянку та центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв.
У стерильну центрифужну склянку переносять 20,0-50,0 мл надосаду, заморожують і зберігають при температурі -20 град. С впродовж однієї доби.
Через добу надосад розморожують при +20 град. С і повторно центрифугують у тому самому режимі. Після центрифугування відбирають надосад у стерильний скляний посуд. Маркують. Зразок готовий для подальшого дослідження.
Проби стічної води, відібрані в стерильний скляний посуд, поміщають у холодильник або у холодну кімнату при температурі +4 град. С. Стічній воді дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, потім верхній шар стічної рідини в об'ємі 1,0 л відливають і маркують. Зразок готовий для подальшого дослідження.
Якщо відібрані проби стічної води дуже сильно забруднені твердими відходами, фекаліями або каламутні і мають майже чорний колір, то для прискорення осідання цих домішок проби попередньо центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. або фільтрують через простерилізований фільтр, виготовлений з фільтрувального паперу або вати. Надосад або освітлений фільтрат відбирають в об'ємі 1 л та використовують для подальшого дослідження.
Доцільно половину проби стічної води використати для концентрування в ній вірусу, а другу половину зберігати як резерв при температурі +4 град. С до успішного завершення етапів концентрування та індикації вірусу.
4.2. Обробка води поверхневих та підземних водойм
Проби води, відібрані в стерильний посуд і доставлені в лабораторію, поміщають у холодильник або у холодну кімнату при температурі +4 град. С, дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, а потім верхній шар води в об'ємі 2,0 л відливають і використовують для подальшого дослідження.
4.3. Обробка питної води
Проби питної води в об'ємі 10 л, відібрані в стерильний посуд і доставлені в лабораторію, поміщають у холодильник або холодну кімнату при температурі +4 град. С, дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, а потім вдаються до дехлорування (див. Розділ 3.3).
Проби води, звільнені від хлору, використовують для подальшого дослідження.
5. Методи концентрації вірусів у пробах води
Методи, що застосовують для концентрації вірусів у пробах води, повинні відповідати таким вимогам: можливість концентрувати малу або навіть незначну кількість патогенних для людини вірусів, наявних у великих об'ємах води; забезпечувати відокремлення вірусів від бактерій та інших контамінантів; сконцентрований вірусний матеріал має зберігати життєздатність для подальшого вірусологічного дослідження.
Методи концентрації вірусів з води можна умовно поділити на групи:
- фізичні (ультрацентрифугування, фільтрація, ультрафільтрація, пінна флотація, електрофорез та електроосмос);
- фізико-хімічні (осадження за допомогою сульфату амонія, сульфату алюмінія, концентрація поліетиленгліколем, двохфазний метод із застосуванням ПЕГ 6000 та декстрану Т40 Amersham-Pharmacia та ін.);
- адсорбційні (адсорбція на марлевих тампонах, активованому вугіллі, природних мінеральних сорбентах - бентоніті, асканіті та ін., на іоно-обмінних смолах, аміноетоксиаеросилі, поліметилксилоксані, макро-пористому склі, двохфазний метод та ін.).
Вибір методу концентрації вірусів у пробах води залежить від багатьох чинників: ступеня забруднення води, чутливості методики, доступності стандартизованого адсорбенту, наявності відповідного обладнання (наприклад, ультрацентрифуг з охолодженням або спеціального обладнання для ультрафільтрації) та навантаження на лабораторію.
Санітарно-вірусологічний моніторинг за забрудненням води (стічної, поверхневих та підземних водойм, питної), як правило, в практичних лабораторіях проводиться за кількома показниками (ентеровіруси, ротавіруси, аденовіруси, віруси гепатиту А, коліфаги), тому доцільно використовувати такий спосіб концентрації і використовувати єдиний реактив для концентрації, який би дозволяв визначати декілька показників вірусів одномоментно.
Усі роботи, пов'язані з концентрацією та виділенням вірусів, здійснюються за умови дотримання правил безпеки (при роботі зі збудниками III-IV групи патогенності) у повній відповідності до регламентуючих документів (див. Список використаних джерел).
5.1. Концентрація вірусів методом фільтрації через фільтр з матеріалу Петрянова
Фільтр з матеріалу Петрянова (далі ФП) фіксують у будь-якому утримувачі фільтру, прикладаючи до решітки тою чи іншою його стороною, оскільки обидві поверхні фільтру ідентичні. Діаметр ФП може дорівнювати 3-14 см.
Досліджувану пробу води, що попередньо пройшла обробку (див. Розділ 4), пропускають під тиском через фільтрувальну установку або спеціальну насадку з утримувачем фільтру. Після проходження всієї досліджуваної проби води через фільтр та адсорбції на ньому вірусів його видаляють стерильним пінцетом із утримувача і вміщують у стерильну чашку Петрі.
Для елюції вірусу з поверхні фільтру на нього наносять 1 М розчин NaCl (елюент) з розрахунку 2,0 мл на 10 кв.см поверхні фільтра, тобто 2 мл рідини на фільтр діаметром 3 см. Фільтр промивають, піпетуючи рідину впродовж 2-3 хв., а далі рідину зливають у флакон і отримують елюат I. Процедуру елюції вірусів з фільтру повторюють, елюати I і II об'єднують.
Недоліком методу є швидке засмічення пор фільтру та неповна десорбція вірусу з його поверхні.
5.2. Концентрація вірусів методом осадження за допомогою алюмінія сульфату
Температуру попередньо обробленої проби води доводять до
+20 +- 1 град. С на водяній бані чи за допомогою термостату.
До 1 л води додають 2 мл 10% розчину алюмінія сульфату
(Al (SO ) ), ретельно перемішують, рН води краплинами доводять до
2 4 3
значень 5,4-5,8. Для цього застосовують 1 М розчин HCl або 1 М
розчин NaOH.
Досліджувану пробу (рН 5,4-5,8) із внесеним в неї розчином алюмінія сульфату витримують при температурі +18-20 град. С впродовж 4 годин, або при температурі +4 град. С - впродовж 18 годин. Прозорий надосад обережно зливають та викидають, а білий аморфний осад, що містить у собі віруси, переносять у центрифужну склянку або пробірку і центрифугують при 2000 об./хв. впродовж 10-15 хв. Надосад знову видаляють, а осад, що став більш щільним, суспендують у 4,0 мл розчину Хенкса (рН 7,4) для елюції вірусів і знову центрифугують за вказаних вище умов. Для подальшого дослідження відбирають вже надосад (елюат), в якому міститься сконцентровані віруси, а осад алюмінія сульфату, звільнений від вірусу, викидають.
В якості елюентів, окрім розчину Хенксу (рН 7,4), можна використовувати 0,5 М фосфатний буфер (рН 8,2) та ін.
Проби води, оброблені солями алюмінію, зберігають тільки при температурі +4 град., ні в якому разі не заморожуючи їх.
5.3. Концентрація вірусів за допомогою гідрогелю метилкремнієвої кислоти
Дослідження починають з підготовки гідрогелю метилкремнієвої кислоти (далі ГГМКК), що випускається вітчизняним виробником ЗАТ "Екологоохоронна фірма "КРЕОМА-ФАРМ", м. Київ, N Р/П Р.11.02/05576.
В основі методу лежить принцип фізичної адсорбції кремнійорганічною матрицею ПМС рота-, ентеро-, кишкових аденовірусів людини, ВГА з проб води. Пориста структура ГГМКК характеризується стабільним складом, питомою сорбційною поверхнею 100-150 кв.м/г, сумарним об'ємом пор 2,7-3,0 см/г, радіусом пор понад 100 нм, високою ефективністю адсорбції ротавірусів (70-75 нм), ентеровірусів (28-30 нм), ВГА (27-30 нм), аденовірусів 40 та 41 типів (80-90 нм). Використовують дрібнодисперсну форму ГГМКК.
ГГМКК попередньо розфасовують по 1 г та по 20 г для зручності використання.
ГГМКК у пробу води додають з розрахунку 1,0 г на 0,5 л.
Концентрація вірусів у пробах стічної води: досліджувані проби води доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води від'юстовують до значення 5,0, додаючи краплинами 1 М розчин HCl.
До 0,5 л освітленої та підкисленої проби стічної води додають 1,0 г Ентеросгелю, ретельно та енергійно струшують вручну (4-5 хв.) або струшують автоматично впродовж 10-20 хв.
Проби води із внесеним Ентеросгелем розливають у стерильні центрифужні склянки або скляні флакони (зручно використовувати флакони з-під поживних середовищ для культури клітин або з-під трипсину для культур клітин об'ємом 250 мл чи 500 мл) та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. або відстоюють 14-16 годин. Білий осад, який утворився, є дуже легким, не щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні склянки або флакону не тільки осад, а ще й надосад (загальний об'єм 20 мл). Цей залишок струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують за вказаних вище умов. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірки, а надосад легко видаляють пастерівською піпеткою або дозатором і в роботі більше не використовують.
До отриманого осаду, що являє собою осаджений комплекс "вірус-ГГМКК", у кожну центрифужну пробірку додають 2,0 мл 0,05 М трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок ГГМКК, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (загальний об'єм 4 мл), і використовують для подальшого дослідження.
В якості елюентів, окрім 0,05 М трис-буферу з рН 8,4, можна використовувати 0,05 М фосфатний буфер, рН 8,4.
Процес концентрації вірусів з проб займає загалом не більше 1,5-2,0 годин.
Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробах стічної води надана у табл. 6.1.
Таблиця 6.1.
Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробі стічної води
|
Етап |
Матеріал |
Обробка |
Тривалість |
|
Адсорбція |
Проба стічної |
- Додати 1 М HCl до рН 5,0 |
20-40 хв. |
|
Нещільний |
- Струшувати впродовж |
До 30 хв. |
|
|
Елюція |
Осад після |
- Додати 2,0 мл у кожну |
До 30 хв. |
|
Елюат (4 мл) використовують для подальшого |
Загальні |
||
Концентрація вірусів у пробах води поверхневих (відкритих) або підземних водойм: досліджувані проби води доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води від'юстовують до значення 5,0, додаючи краплинами 1 М розчин HCl.
До 1 л досліджуваної проби додають 2,0 г ГГМКК. При роботі з 2 л води відповідно вносять 4,0 г ГГМКК.
Проби води із внесеним ГГМКК розливають у стерильні центрифужні склянки або скляні флакони на 500 мл та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. Білий осад, який утворився, є дуже легким, не щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні склянки або флакону осад. Загальний об'єм осаду має не перевищувати 20 мл! Осад струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірки, а надосад легко видаляють і в роботі більше не використовують.
До отриманого осаду, що являє собою комплекс "вірус-ГГМКК", в кожну центрифужну пробірку додають 2,0 мл 0,05 М трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок Ентеросгелю, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (4 мл), і використовують для подальшого дослідження.
Схема концентрації вірусів Ентеросгелем у пробах води поверхневих (відкритих) або підземних водойм надана у табл. 6.2.
Таблиця 6.2.
Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробі води поверхневих (відкритих) та підземних водойм
|
Етап |
Матеріал |
Обробка |
Тривалість |
|
Адсорбція |
Проба води |
- Додати 1 М р-н HCl до |
До 40 хв. |
|
Нещільний білий |
- Струшувати впродовж |
До 30 хв. |
|
|
Елюція |
Осад після |
- Додати 2,0 мл у кожну |
До 30 хв. |
|
Елюат (4 мл) направляють для подальшого дослідження |
Загальні |
||
Концентрація вірусів у пробах питної води: проби води попередньо звільняють від хлору, доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води і доводять до значення 5,0, додаючи краплинами 1 М розчин HCl.
До проби водопровідної води/питної води об'ємом 10-20 л додають відповідно 20-40 г ГГМКК, який вносять безпосередньо у скляний посуд.
Не застосовуйте ГГМКК, якщо проба води знаходиться у металевому бідоні! Це утруднює відокремлення його від надосаду!
Для ефективної адсорбції вірусів Ентеросгелем, пробу струшують вручну або автоматично. Утворений комплекс "вірус-ГГМКК" осаджують шляхом відстоювання при температурі +4 град. С впродовж 14-18 годин. Так, наприклад, якщо проби води доставлені до лабораторії у другій половині або наприкінці робочого дня, то після вказаної вище підготовки та обробки ГГМКК вони можуть бути залишені для седиментації осаду до ранку при кімнатній температурі 20 +- 1 град. С. Далі надосад обережно зливають через край, залишаючи на дні скляного посуду 200 мл нещільного білого осаду. Цей залишок (осад + невелика кількість надосаду) струшують і переносять у центрифужні стакани або флакони на 250 мл та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. Білий осад, який утворився після центрифугування, є ще також ще не досить щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні флакону близько 20 мл. Цей залишок струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують за тим самим режимом. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірок, а надосад легко видаляють пастерівською піпеткою або дозатором і в роботі більше не використовують.
До отриманого осаду, що являє собою осаджений комплекс "вірус-ГГМКК", в кожну центрифужну пробірку додають по 2,0 мл 0,05 М трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок ГГММКК, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (4 мл), і використовують для подальшого дослідження.
Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробах питної води надана у табл. 6.3.
Таблиця 6.3.
Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробі питної води
|
Етап |
Матеріал |
Обробка |
Тривалість |
|
Адсорбція |
Проба питної |
- Додати 1 М р-н HCl до |
До 20 год. |
|
Нещільний |
- Центрифугувати при |
До 30 хв. |
|
|
Нещільний |
- Струшувати впродовж |
До 30 хв. |
|
|
Елюція |
Осад після |
- Додати 2,0 мл у кожну |
До 30 хв. |
|
Елюат (4 мл) направляють для подальшого |
Загальні |
||
5.4. Концентрація вірусів за допомогою бентоніту
|
20 |
|||
|
50 |
ріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.
4. Поява специфічної смуги 207 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) указує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Вимагається повторити аналіз проб, а також вжити заходам по виявленню джерела контамінації.
7.4. Дослідження проб на наявність віруса гепатиту А
7.4.1. Визначення вірусних антигенів ВГА в ІФА
Елюати, отримані після концентрування досліджуваних об'ємів води, аналізуються методом ІФА у відповідності до Інструкціїї, що додається до стандартного комерційного діагностичного набору, зареєстрованого в Україні.
7.4.2. Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією
Для проведення дослідження рекомендовано використовувати сертифіковані тест-системи.
Для проведення аналізу використовуються проби води без додаткової концентрації або концентрат (елюат). Зразок у кількості 0,5-1 мл переносять в пробірки типу "еппендорф", що вільні від РНКаз та ДНКаз.
Проби зберігають при 2-8 град. С не більше одної доби, тривало - при мінус 70 град. С. Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу.
Доставка проб здійснюється в спеціальному термоконтейнері з охолоджуючими елементами.
Проведення аналізу
ПЛР-аналіз складається з чотирьох етапів, кожний з яких має свої контрольні зразки:
- виділення РНК;
- отримання комплементарной ДНК (кДНК) на матриці РНК - реакція зворотної транскрипції (ЗТ);
- ампліфікація ділянки ДНК - полимеразная ланцюгова реакція (ПЛР);
- електрофоретический аналіз продуктів ПЛР і облік результатів ПЛР-аналізу.
Етап 1. Виділення РНК (проводиться в Зоні 1 - кімнаті для обробки матеріалу)
Порядок роботи
1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.
2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку 5 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ HAV-rec). Потім по 450 мкл лізуючого розчину. Маркірувати пробірки.
3. В пробірки з лізуючим розчином та ВКЗ внести по 100 мкл проб, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. В пробірку негативного контролю (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). В пробірку позитивного контролю (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ HAV-rec).
4. Щільно закриті проби, ретельно перемішати на вортексі і ценрифугувати впродовж 5 с при 5 000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.
5. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. В кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.
6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. протягом 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
7. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 2. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. Ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.
9. Повторити відмивання розчином для відмивання 2, згідно з пунктом 8.
10. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 3. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.
11. Помістити пробірки в термостат 60 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбента. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.
12. В пробірки додати по 50 мкл РНК-елюента, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат 60 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і центрифугувати пробірки на максимальних оборотах мікроцентрифуги (12 000-13 000 об./хв.) протягом 1 хв.
Супернатант містить очищені РНК. Проби готові до постановки реакції зворотної транскрипції і ПЛР.
Реакцію зворотної транскрипції слід проводити відразу після отримання РНК-проби. Відбирати розчин РНК/ДНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент. Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його на центрифузі.
Етап 2. Постановка реакції зворотної транскрипції і проведення ПЛР (проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації).
Постановка реакції зворотної транскрипції (загальний об'єм реакції - 20 мкл, об'єм РНК-проби - 10 мкл)
Порядок роботи
При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові витратні матеріали, що мають спеціальну маркіровку "RNase-free", "DNase-free".
1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.
2. Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT додати 125 мкл RT-mix і ретельно перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.
3. До отриманого розчину додати 6 мкл ревертази, перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.
4. Внести в мікропробірки по 10 мкл готовій реакційній суміші.
5. Використовуючи наконечники з бар'єром, додати 10 мкл РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю. Обережно перемішати.
6. Поставити пробірки в ампліфікатор (термостат) на 37 град. С на 30 хв.
7. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК для подальшої постановки ПЛР розвести в 2 рази ДНК-буфером (до 20 мкл кДНК окремим наконечником додати 20 мкл ДНК-буфера).
Готовий препарат кДНК можна зберігати при температурі мінус 20 град. С протягом тижня або при температурі мінус 70 град. С протягом року.
Постановка ПЛР (загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл)
У всіх комплектах для ампліфікації сімейства АмпліСенс обов'язково застосовується "гарячий старт". Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С.
Підготовка пробірок для проведення ПЛР
1. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.
2. На поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1.
3. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).
Порядок роботи
1. Узяти підготовлені для ПЛР пробірки. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл кДНК, отриманих в реакції зворотної транскрипції РНК.
Позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ПКЗ кДНК.
Негативний контроль ПЛР (К-) - внести в пробірку 10 мкл ДНК-буфера.
2. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (дивися інструкцію до набору).
3. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (Зону 3). Проби після ампліфікації можна берегти 16 годин при кімнатній температурі, протягом тижня при 2-8 град. С.
Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації (проводиться в зоні 3 - кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації)
Робота з ампліфікованими ДНК повинна проводитися в нкремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.
Порядок роботи
1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю. В кожному ряді доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+.
2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хв. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.
3. Після закінчення електрофорезу, вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.
При дослідженні гелю і фотографуванні очі повинні бути захищений спеціальною маскою або скляною пластиною!
Облік результатів
Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться по наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг ампліфікованої кДНК.
Довжина специфічних смуг ампліфікованих фрагментів кДНК:
- вірусу гепатиту А (HAV) - 430 п.н.
- внутрішнього контролю (ВКЗ) - 680 п.н.
1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві оранжеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 430 п.н. і смуга внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ) - на рівні 680 п.н. (табл. 8.6.)
Таблиця 8.6.
Оцінка результатів аналізу контрольних зразків
|
Контрольний |
Контрольований |
Специфічні смуги на |
|
|
Смуга 430 п.н. |
Смуга 680 п.н. |
||
|
"ПК" |
Виділення РНК |
Є |
Є |
|
"НК" |
Виділення РНК |
Ні |
Є |
|
"К-" |
ПЛР |
Ні |
Ні |
|
"К+" |
ПЛР |
Є |
Ні |
2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), повинна бути тільки смуга ВКЗ на рівні 680 п.н.
3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна оранжева смуга на рівні 430 п.н., що світиться.
4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинне бути ніяких смуг.
5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 430 п.н. більшої або меншої інтенсивності, незалежно від наявності смуги внутрішнього контролю. Смуга внутрішнього контрольного зразка може бути відсутній в пробах з високою концентрацією РНК.
6. Негативними вважаються зразки, які містять тільки смугу 680 п.н. більшої або меншої інтенсивності
7. Окрім смуг 430 п.н. і 680 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.
Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:
1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з наприведеними в табл. 8.6., то відповідний етап аналізу слід переробити.
2. Якщо в доріжці якій-небудь з проб відсутні обидві смуги, і 430 п.н. і 680 п.н., результат аналізу по даній пробі вважається недійсним, необхідно повторити дослідження цієї клінічної проби із самого початку. Причиною могла з'явитися помилка в процедурі обробки клінічного матеріалу, що привела до втрати РНК/ДНК або інгібування ЗТ та/або ПЛР.
3. У доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.
4. Поява специфічної смуги 430 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) указує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Вимагається повторити аналіз проб, а також вжити заходи по виявленню джерела контамінації.
8. Методи дослідження проб на наявність кишкових фагів
З багаточисельної групи фагів як санітарно-показові віруси визначені постійно наявні у кишечнику людини соматичні коліфаги, які у великій кількості потрапляють у стічні води, у водойми зі стічними водами та поверхневим стоком і, як слідство, у питну воду (водопровідну, колодязну та інші джерела).
Коліфаги - це бактеріальні віруси, котрі складаються з капсиду, який вміщує одно- або двуниткову ДНК в якості геному.
Виявлення у воді кишкових бактеріофагів може свідчити про наявність патогенних вірусів, особливо у питній воді. Наявність їх у воді з резервуару чистої води станції водопідготовки вказує на недосконалість технології водопідготовки, а у воді з мережі водопостачання, крім вказаного, - про наявність умов вторинного забруднення, зокрема збудниками вірусних інфекцій.
Коліфаги слугують найбільш адекватною моделлю оцінки ефективності того чи іншого прийому очистки та знезараження води від вірусів. Методи їх визначення доступні лабораторіям любого рівня, не потребують спеціального обладнання та дають можливість отримати результати вже через 6-24 годин.
Бактеріофаги здатні інфікувати певні штами хазяїна E.coli та утворювати видимі бляшки (зони лізису, прозорі зони) різного розміру та морфології на зливному газоні бактеріального росту хазяїна за відповідних умов культивування. Визначення коліфагів можна проводити двома методами:
- титраційним методом (метод накопичення) або найбільш вірогідного числа (НВЧ);
- прямим методом без попередньої концентрації коліфагів та після їх концентрації.
Титраційний метод дозволяє виявляти незначну кількість коліфагів в об'єкті, але загальний об'єм води, як правило, не перевищує 1 л. Цей метод застосовується при дослідженні питної води після очистки та знезараження, води з розподільчої системи або інших малозабруднених об'єктів. Отримання результату можливе через 24-48 годин.
Прямий метод застосовується для визначення коліфагів у стічній воді та інших водних об'єктах зі значним антропогенним забрудненням. Застосування прямого методу визначення коліфагів у питній воді має технічну обмеженість внаслідок неможливості дослідження великих об'ємів. В той же час він застосовується для визначення коліфагів у питній воді та інших видах чистих вод після попередньої концентрації фагів з великих об'ємів у малі. Використовують методи концентрації хлоридом алюмінія та ГГМКК. Результат отримують через 6-24 годин.
8.1. Відбір проб для дослідження
Відбір проб різних видів вод для дослідження на наявність коліфагів відрізняється від вказаного в Розділі 4 цих методичних рекомендацій об'ємом проб. Стічну воду відбирають об'ємом 100 мл. Воду з інших об'єктів відбирають об'ємом 1000 мл, якщо не передбачена концентрація. При необхідності концентрації коліфагів пробу відбирають об'ємом 10 л.
Необхідність концентрації коліфагів доречно проводити у пробах води за епідпоказниками, коли дослідження води на патогенні віруси негативні, а коліфаги в 1000 мл не визначаються, у той час, як реєструється захворюваність населення на вірусні інфекції з водним шляхом передачі.
Концентрація коліфагів також доречна при дослідженні різних видів питної води з метою надати у короткий строк більш достовірну оцінку можливості проходження вірусів через ті чи інші етапи очисних споруд та можливої наявності вірусів в інших видах вод (колодязній, зі скважини, каптажів, інших індивідуальних джерел питної води).
Незадовільна якість води за санітарно-хімічними та бактеріологічними показниками також може спонукати до визначення коліфагів з їх попередньою концентрацією, що суттєво доповнить характеристику води та роботу очисних споруд стосовно антивірусного бар'єру.
8.2. Дослідження проб стічної води
Кількість коліфагів у стічній воді, як правило, знаходиться на рівні сотень та сотень тисяч в одному мл в залежності від характеру стічних вод та ступеня їх очистки. Допустимий рівень коліфагів в очищеній стічній воді, яку дозволено скидати у водоймище, повинен дорівнювати 1000 бляшкотвірних одиниць в літрі (БТО/л) (СанПиН 4630-88 "Охрана поверхностных вод от загрязнения", Москва, 1988). Стічну воду досліджують двошаровим методом посіву за Граціа. Метод складається з наступних складових:
- приготування тест-культури хазяїна E.coli В або E.coli С;
- приготування чашок Петрі з 2% м'ясо-пептонним агаром (МПА) для нижнього шару;
- приготування суміші відповідних об'ємів досліджуваної проби, культури хазяїна E.coli та 1,0% МПА для верхнього шару агара;
- контроль можливої контамінації фагом середовищ і матеріалів, які використовуються (негативний контроль);
- контроль чутливості тест-культури хазяїна до соматичних коліфагів (позитивний контроль).
Приготування тест-культури хазяїна, постановку негативного та позитивного контролів виконують відповідно до пунктів 11.1.1.; 11.1.4.; 11.1.5 Методичних вказівок MB 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
8.2.1. Проведення аналізу
Розтоплюють 2,0% МПА і розливають у чашки Петрі по 15-20 мл в
кожну. Флакон зі 100 кв.см 1,0% МПА розтоплюють і доводять до
48 град. С на водяній бані. Використовують десятикратні
розбавлення проби стічної води від 102 до 1012. Всі дози посівів
досліджують у двох повторностях. Вихідну воду досліджують по 1 мл
2 4
з розбавлень (наприклад, 10 та 10 ). Воду після повного циклу
очистки та знезараження досліджують в об'ємі 1 мл вихідної води та
2
з розбавлення 10 . Приготовлені розбавлення по 1 мл розливають у
два ряди пробірок, додають 0,5 мл "нічної" бульйонної культури
хазяїна, 5 мл розтопленого 1,0% МПА та виливають на приготовлений
заздалегідь шар 2,0% МПА у чашках Петрі. Виливають приготовлену
суміш (верхній шар) на нижній шар агару і швидко розподіляють по
поверхні агару, дають можливість застигнути та інкубують у
термостаті при 36 +- 1 град. С протягом 6 годин, після чого
виймають і підраховують кількість бляшок лізису культури хазяїна,
тобто БТО на чашці. Після підрахунку БТО чашки з посівами
залишають до слідуючого дня при кімнатній температурі і роблять
остаточний підрахунок БТО та їх розрахунок на одиницю об'єму
(на мл чи на л в залежності від точки відбору проб). В разі
неможливості інкубації при двух температурах надають перевагу
інкубації при 36 +- 1 град. С. Результат вважається прийнятним при
одержанні відповідних позитивного та негативного контролів.
8.3. Дослідження проб води поверхневих водоймищ
Воду поверхневих водоймищ досліджують об'ємом 10-100 мл в залежності від ступеня їх забруднення. Нижня границя досліджуваного об'єму (10 мл) обумовлена нормативом допустимого рівня коліфагів води поверхневих водоймищ, який дорівнює 100 БТО в одному літрі води. При цьому використовують прямий метод посіву, описаний в п. 9.21 цих методичних рекомендацій з деякими змінами, викладеними нижче. Від загального об'єму проби води відбирають 10 мл і розподіляють цей об'єм по 2,0 мл у 5 пробірок, куди додають 0,5 мл бульйонної культури хазяїна E.coli В, та 5 мл 2,0% МПА. Виливають отриману суміш на нижній шар 2,0% МПА, розлитого в чашки Петрі. Інкубацію проводять як описано в п. 9.2.1. Підраховують загальну кількість БТО на чашках сумарно та розраховують їх кількість в 1 л води.
8.4. Дослідження проб питної води
Питна вода з різних джерел водопостачання досліджується об'ємом 1 л. У відповідності з діючою нормативною документацією коліфаги у питній воді повинні бути відсутніми в об'ємі 1 л (ДСанПіН "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", Київ, 1999). Для дослідження використовується титраційний метод (метод накопичення, або НВЧ) у відповідності з розділом 11.1 Методичних вказівок MB 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
В разі необхідності концентрації коліфагів досліджують пробу об'ємом 10 л. Застосовують метод осадження хлоридом алюмінія або сорбції ГГМКК.
Осадження хлоридом алюмінія. У пробу води, підігріту до
18-20 град. С, додають 10% розчин хлориду алюмінія з розрахунку
2 мл на 1 л проби. Доводять рН до 5,8-6,0, обережно перемішують
пробу до утворення пластівців. Залишають пробу на 16-18 годин при
4 град. С до утворення осаду (при неможливості залишають пробу при
кімнатній температурі). Надосадову рідину зливають, а пухкий осад
переносять у чотири 250 мл флакони та центрифугують при
2000 об./хв., протягом 15 хв. Надосадову рідину зливають. У кожний
флакон додають елюент - по 5,0 мл м'ясо-пептонного бульйону (МПБ)
подвійної концентрації з 10% Na HPO (рН 9,2). Флакони з елюентом
2 4
інтенсивно струшують 10 хв. Після цього осад з елюентом переносять
в один флакон і знов центрифугують при вказаному режимі,
надосадову рідину збирають в окремий флакон і досліджують прямим
методом посіву як вказано вище у пункті 5.3. Отриманий об'єм
елюенту розподіляють по 2,0 мл у відповідну кількість пробірок, до
них додається все необхідне у відповідності до пункту 8.3.
|
Заступник директора |
|
СПИСОК
використаних джерел
1. Основи законодавства України про охорону здоров'я.
2. "Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні", затв. Постановою Кабінету Міністрів України 22.06.99 N 1109, в редакції Постанови Кабінету Міністрів України від 19.08.02. N 1217.
3. Закон України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення".
4. Закон України "Про захист населення від інфекційних хвороб".
5. ДСП № 9.9.5.064.2000 "Порядок видачі дозволів на роботу із мікроорганізмами 1-4 груп патогенності та рекомбінантними молекулами ДНК".
6. Постанова від 27.05.1998 р. N 11 "Про порядок розробки, викладення, оформлення, затвердження державних санітарних правил і норм, гігієнічних нормативів та методичних документів".
7. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. ВОЗ-2003.
8. "Правила функціонального устрою та експлуатації приміщень лабораторії молекулярно-генетичних досліджень".
9. "Методичні рекомендації по проведенню робіт в діагностичних лабораторіях, які використовують метод полімеразної ланцюгової реакції", Київ, 1995.
10. Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я № 219-2005. Концентрація ротавірусів із стічних вод за допомогою поліметилсилоксанового адсорбенту "Ентеросгель". Автори: Дзюблик І.В., Обертинська О.В., Миколенко Н.І., Київ, 2005.
11. Методичні вказівки МВ 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
12. СанПин 4630-88 "Охрана поверхностных вод от загрязнения", Москва, 1988.
13. ДСанПін "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", Київ, 1999.
14. Методичні рекомендації "Організація роботи лабораторії при дослідженні біоматеріалу методом полімеразної ланцюгової реакції", Київ, 2007.
15. Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я № 247-2005 "Застосування швидких імунохроматографічних тестів в діагностиці ротавірусної інфекції у дітей в спеціалізованих дитячих лікувальних закладах". Дзюблик І.В., Ковалюк О.В., Обертинська О.В., Костенко О.О., Київ, 2005.
Додаток 1
до Методичних вказівок
АПАРАТУРА,
основні матеріали, реактиви, поживні середовища
Для проведення санітарно-вірусологічного дослідження використовують:
- Автоклав великий (або настільний для маленьких лабораторій).
- Бокс біологічної безпеки з запасними фільтрами безпеки II класу (ламінарна шафа).
- Ваги (аналітичні , електронні, торсійні, лабораторні).
- Водяна баня.
- Дистилятор води електричний.
- Дозатори автоматичні (одно- та восьмиканальні).
- Ізотермічні сумки.
- Камера підрахунку клітин.
- Колби скляні з градуйованою горловиною.
- Колби скляні лабораторні.
- Мікроскоп інвертований.
- Морозильна камера (-20 град. С) типу прилавка; морозильна камера (-70 град. С).
- Одноразовий посуд для культивування культур клітин - стерильні культуральні флакони, пробірки, планшети, піпетки тощо.
- Посуд для відбору проб води з об'єктів довкілля.
- Посуд медичний скляний.
- Пробірки скляні.
- Пробки конусоподібні.
- РН-метр з запасними електродами будь-якої марки або фірми-виробника.
- CO -інкубатор.
2
- Стерильні скельця для культури клітин.
- Сухожаровий стерилізатор.
- Термометри стандартні (0-100 град. С).
- Апарат для фільтрації будь-якої марки або фіми-виробника.
- Ультрафільтраційна система "Мінітан".
- Термостати електричні, сухожарові з автоматичним терморегулятором до 50 град. С.
- Утримувач фільтрів розміром 30, 70, 140 мм.
- Холодильник побутовий елетричний з температурою камери 4-6 град. С.
- Центрифуга лабораторна рефрижераторна.
- Центрифуга низькошвидкісна з охолодженням.
- Циліндри вимірювальні ємністю 100, 250, 500 куб.см.
- Чашки Петрі (діаметром 90-100 мм).
- Алюміній сірчанокислий.
- Аеросил-300, Калушського дослідного виробництва IX поверхонь АН України (Івано-Франківська обл.), ГОСТ 14922-77.
- Вата медична гігроскопічна.
- Калій фосфорнокислий двозаміщений.
- Кислота оцтова.
- Трис буфер 0,05 М рН 8,4
- Лейкопластир.
- Марля медична.
- Натрій фосфорнокислий двозаміщений безводний.
- Поліетиленгліколь з М.В. 6000, 4000.
- Гідрогель метилкремнієвої кислоти ГГМКК виробництва КРЕОМА ФАРМ, Київ (вул. Радищева, 3; м. Київ, Україна 03680, тел. (044) 455-35-40/41 тел./факс (044) 497-95-45).
- Розчин версену.
- Розчин трипсину 0,25%.
- Розчин Хенкса, рН 7,0.
- Середовище RPMI -1640, рН 7,3.
- Середовище Ігла ДМЕМ для культури клітин, рН 7,2.
- Середовище Ігла МЕМ для культури клітин, рН 7,2.
- Середовище Ігла, рН 7,2.
- Сироватка великої рогатої худоби без консерванту, виробництва
- Сироватка теляча ембріональна без консерванту.
- Спирт етиловий ректифікований.
- Фільтр типу Петрянова.
- "Набор для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды в системе децентрализованого хозяйственно-питьевого водоснабжения поверхностных и сточных вод", производства ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Республики Беларусь, г. Минск, тел./факс (375017) 2-26-52-63, ТУ РБ 100558032.047-2001, Регистрационное удостоверение N ИМ-7 1705.
Додаток 2
до пп. 8.1.5, 8.2.3,
8.3.2, 8.4.2
Методичних вказівок
ПЕРЕЛІК
устаткування ПЛР-лабораторії
Для обробки матеріалу і виділення НК:
1. Бокс біологічної безпеки II класу.
2. Центрифуга клінічна для пробірок об'ємом 5-100 мл.
3. Центрифуга - вортекс.
4. Мікроцентрифуга від 12 до 16 000 g для мікроцентрифужних пробірок об'ємом 1,5 мл.
5. Твердотільний термостат для пробірок об'ємом 1,5 мл діапазоном робочих температур 25-100 град. С.
6. Набір автоматичних піпеток змінного об'єму (мінімум 3 піпетки: до 20 мкл, до 200 мкл і до 1000 мкл).
7. Одноразові поліпропіленові мікроцентрифужні пробірки з кришками, що загвинчуються або щільно закриваються, об'ємом 1,5 мл.
8. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму до 200 і до 1000 мкл.
9. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму з аерозольним бар'єром до 20, 200 і до 1000 мкл.
10. Штативи для наконечників та мікро пробірок об'ємом 1,5 мл.
11. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
12. Посуд з дезінфікуючим розчином.
Для приготування ПЛР-суміші і проведення ампліфікації:
1. Настільний ПЛР- бокс з бактерицидною лампою.
2. Ампліфікатор (термоциклер).
3. Набір автоматичних піпеток змінного об'єму (мінімум 3 штуки).
4. Одноразові поліпропіленові пробірки для ампліфікації об'ємом 0,5 або 0,2 мл (в залежності від марки ампліфікатора).
5. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму з аерозольним бар'єром до 20 та 100 мкл.
6. Штативи для наконечників та мікро пробірок на 0,5 або 0,2 мл.
7. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
8. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
9. Детектор флюоресценції типу "Джин" (при необхідності).
Для електрофоретичного аналізу продуктів ПЛР:
1. Камера для горозинтального електрофорезу.
2. Джерело постійного струму з напругою 150-460 В.
3. Транс ілюмінатор з кабінетом або камерою для перегляду гелів.
4. Відеосистема з цифровою відеокамерою для реєстрації результатів.
5. Комп'ютер для аналізу результатів електрофорезу.
6. Мікрохвильова піч для плавлення агарози.
7. Колба конічна з термостійкого скла для плавлення агарози об'ємом 250 мкл.
8. Мірні циліндри об'ємом 1 л та 100 мл.
9. Штатив для мікропробірок на 0,5 мл.
10. Окрема автоматична піпетка до 20 мкл.
11. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму до 20 мкл в штативі.
12. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
13. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
Для гібридизаційно-ферментної детекції продуктів ПЛР:
1. Термостат планшетний, що підтримує температуру 37 град. С.
2. Вошер (не обов'язково).
3. Планшетний спектрофотометр.
4. Комп'ютер (повинен бути зв'язаний через комп'ютерну мережу з комп'ютером, розташованим у чистій зоні і призначений для аналізу результатів гібридизації).
5. Вісьмиканальна піпетка до 200 мкл.
6. Окремий набір одно канальних автоматичних піпеток змінного об'єму.
7. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму.
8. Мірний циліндр об'ємом 1 л.
9. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
10. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
Додаток 3
до п. 6.4
Методичних вказівок
ОДЕРЖАННЯ ГЕЛЮ БЕНТОНІТА
Шматки сухого бентоніту (наприклад, Курцівського родовища) диспергують у п'ятьох об'ємах дистильованої води (вага : об'єм). Для переходу бентоніту в натрієву форму до суспензії додають вуглекислий натрій (вуглекислий натрій ДСТ 4201-66) до 1 М концентрації, витримують 1 день при кімнатній температурі і кип'ятять на невеликому вогні при помішуванні впродовж одної години. Центрифугують 10 хв. при 2000 об./хв., надосадову рідину видаляють, осад суспендують у потрійному об'ємі дистильованої води в гомогенізаторі типу РТ-2. Центрифугують 15 хвилин при 2000 об./хв. Сама нижня частина осаду, що складається із забруднюючих речовин, відділяється. Інший осад тричі відмивають у потрійному об'ємі дистильованої води протягом 10 хвилин при 2000 об./хв. Відмитий бентоніт заливають 20 об'ємами дистильованої води (стосовно вихідної ваги матеріалу) і струшують у шуттель-апараті 2 години, потім суспензію центрифугують 10 хвилин при 1000 об./хв. Осад, що складається з грубих часток бентоніту і забруднюючих речовин, видаляють. Надосадову рідину (мілкодисперсну фракцію) центрифугують протягом 30 хвилин при 2000 об./хв., при цьому бентоніт седиментується. Осад, крім самої нижньої частини, що містить забруднюючі компоненти, суспендують у 0,14 М розчину NaCl (хлористий натрій ДСТ 4233-6) і знову осаджують при 2000-3000 об./хв. протягом 30 хв. Фракціонування повторюють тричі, видаляючи саму нижню частину осаду. Після третього центрифугировання осад, що представляє собою мілкодисперсну фракцію бентоніту, суспендують у бідистильованій воді до одержання 5-6% суспензії гелеподібної консистенції.
Вміст бентоніту в гелі визначають шляхом його висушування в сухожаровій шафі при 105 град. С с наступним зважуванням сухого залишку. Гель стерилізують автоклавуванням при 0,5 атм протягом 40 хвилин. Гель бентоніту зберігає сорбційні властивості по відношенню до ентеровірусів протягом багатьох років збереження при кімнатній температурі.
Додаток 4
до розділів 6, 7
Методичних вказівок
УЛЬТРАФІЛЬТРАЦІЙНА СИСТЕМА МІНІТАН
В основі роботи ультрафільтраційної системи Мінітан лежить принцип тангенціального потоку через ультрафільтраційні чи мікропористі мембрани. Під дією перестальтичного насосу розчин переходить із резервуару, що знаходиться під атмосферним тиском в корпус із системи Мінітан із швидкістю 100-1000 мл/хв. Зконцентрована фракція повертається в резервуар, а фільтрат збирається в окремому приймачі. Для концентрування вірусів, білків і клітин потрібно вихідний об'єм до 2 л в залежності від бажаного ступіня концентрації.
Завдяки особливостям конструкції пакетика, що має вигляд стопки фільтрів із сепараторів, утворюється постійний плавний потік фракції, що затримується. При такому способі фільтрації відбувається відмивання матеріалу з фільтра за допомогою постійного току рідини, направленим взовж його поверхні. Можливе використання 60 кв.см або 6000 кв.см.
Фірма "Sartorius"
Метод концентрування вірусів у пробах води.
1. Концентрація в системі Sartokon-Mini з модулем (межа відсічення 30 кДа) при пробі V = 3000 мл до V = 400 мл. Час концентрувння - 5 хв.
2. Концентрування на ультраячейці SM 16667 при пробі V = 400 мл, концентрація до V = 1 мл за час 10 хв.
3. Регенерація системи - 20 хв.
4. Загальний час концентрація однієї проби, включаючи регенерацію, 35 хв.
Додаток 5
до розділів 6, 8
Методичних вказівок
МЕТОД
оцінки ефективності концентрації вірусів ("Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. ВОЗ-2003")
Оскільки в кожному алгоритмі дослідження проб води представлені кілька методів концентрації вірусів, то перед тим як вибрати той метод, який планується застосовувати в лабораторії з урахуванням її можливостей та досвіду персоналу необхідно провести оцінку його придатності, тобто атестувати метод в лабораторії. Для цього відому кількість вакцинного поліовірусу типу I (штам Себіна) змішують з відібраною пробою стічної води, далі концентрують вірус із проби тим методом, що планується застосовувати, та визначають кількість поліовірусу типу I в концентраті (елюаті).
Порядок проведення дослідження
1. Готують стандартну серію 10-кратних розведень
вірусовмісного культурального матеріалу з відомим титром
інфекційної активності. Далі розраховують розведення вірусу так,
щоб у об'ємі 100 мл та 1 мл містилось по 20 ТЦД вірусу. З метою
50
перевірки визначеного титру та правильності розрахунків проводять
стандартне титрування в культурі клітин мікрометодом та визначають
титр у вірусовмісному культуральному матеріалі, що був взятий для
дослідження, у зразку об'ємом 100 мл та у зразку об'ємом 1 мл.
2. 1 л проби стічної води ділять на 2 рівні частини. До
однієї з них (0,5 л) додають 20 ТЦД вірусу та проводять
50
концентрування одночасно в двох частинах проби води за вибраним
методом.
3. Після деконтамінації концентрату (елюату) з проби, в яку вносили вірус, відбирають 0,9 мл концентрату і готують наступні розведення на підтримуючому середовищі: 0,7 мл концентрату + 1,4 мл середовища; 0,2 мл концентрату + 1,8 мл середовища. Таким чином, отримують розведення концентрату відповідно 1:3 (2,1 мл) та 1:10 (2,0 мл). Матеріал заморожують та зберігають при мінус 20 град. С.
4. У 5 флаконів на 50 мл з культурою клітин Нер-2 або RD та в 1 флакон на 50 мл з культурою клітин RD(A) на сформовані моношари вносять по 0,5 мл деконтамінованого концентрату (елюату) з проби, в яку вносили вірус.
5. У 2 флакони на 50 мл з культурою клітин Нер-2 або RD та в 1 флакон на 50 мл з культурою клітин RD(A) на сформовані моношари вносять по 0,5 мл деконтамінованого концентрату (елюату) з проби, в яку поліовірус I типу не вносили.
6. Культури клітин поміщають у термостат при 37 град. С та інкубують до формування ЦПД.
7. Якщо хоча б у моношарах 2 флаконів із 6, до яких було внесено концентрат з вірусом, проявляється ЦПД, то метод вважається атестованим. Якщо поліовірус не виявляють, то процедуру тестування проводять повторно, починаючи з п. 2, але вже вносять вірус у дозі 100 ТЦД. У цьому випадку метод вважається атестованим, якщо у всіх 6 флаконах, до яких було внесено концентрат з вірусом, проявляється ЦПД.
Додаток 6
до Методичних вказівок
НОРМАТИВНІ ПОСИЛАННЯ
Основою цих методичних вказівок є такі законодавчі та нормативні документи:
1. Закон України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення".
2. ДСанПіН "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання" (затверджено наказом Міністерства охорони здоров'я України від 23.12.96 за N 383, зареєстровано Міністерством юстиції України від 15.04.97 за № 136/1940).
3. Методическое руководство по биотестированию воды. РД 118.02.09.- М., 1991.
4. Методические указания по санитарно-микробиологическому контролю поверхностных водоемов. № 2285-81.
5. Методичні рекомендації по проведенню епідеміологічного і санітарно-вірусологічного нагляду за якістю джерел водопостачання, питної води в системі водопостачання з метою профілактики захворювання гепатитом А та іншими кишковими вірусними інфекціями. № 01-19/12-13.- К., 1982.
6. Методичні рекомендації по застосуванню бентоніту для виявлення ентеровірусів у людини і в навколишньому середовищі. - К., 1986.
7. Методические рекомендации по контролю и оценке вирусного загрязнение объектов окружающей среды. № 4146-86.- М., 1986.
8. Методические рекомендации "Ротавирусная инфекция" - М., 1989.
9. Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды. - М., 1982.
10. Методичні рекомендації "Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції в умовах практичної вірусологічної лабораторії". - К., 2003.
11. Руководство по контролю качества питьевой воды/ Рекомендации. - Т.І. - Женева: ВОЗ, 1994.
12. Методичні рекомендації "Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції". - К., 2002.
13. Методичні рекомендації "Епідеміологія і профілактика ротавірусної інфекції". - К., 2003.
14. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. - Женева: ВОЗ, 2003.