МУ N 2955-83 Постановка исследований для обоснования предельно допустимых концентраций производственных штаммов микроорганизмов и на их основе готовых форм препаратов в воздухе рабочей зоны

Утверждены

Заместителем Главного

государственного

санитарного врача СССР

23 декабря 1983 г. N 2955-83

Согласовано

Заместителем Председателя

Ученого медицинского совета

Минздрава СССР

26 декабря 1983 года

ПОСТАНОВКА ИССЛЕДОВАНИЙ

ДЛЯ ОБОСНОВАНИЯ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ

ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

И НА ИХ ОСНОВЕ ГОТОВЫХ ФОРМ ПРЕПАРАТОВ

В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Методические указания разработаны:

Всесоюзным научно-исследовательским биотехническим институтом Главмикробиопрома, Научно-исследовательским институтом гигиены труда и профессиональных заболеваний АМН СССР, Рижским медицинским институтом, Всесоюзным научно-исследовательским институтом гигиены и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических масс, Всесоюзным научно-исследовательским институтом антибиотиков, Ангарским научно-исследовательским институтом гигиены труда и профзаболеваний, Научно-исследовательским институтом общей и коммунальной гигиены им. А.Н. Сысина АМН СССР.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Настоящие Методические указания предназначены для специалистов научно-исследовательских учреждений, занимающиеся изучением и обоснованием санитарных нормативов для производственных штаммов микроорганизмов и на их основе готовых форм препаратов в воздухе рабочей зоны.

В производствах микробиологического синтеза широко используются разнообразные микроорганизмы: дрожжеподобные и плесневые грибы, бактерии, с помощью которых получают белково-витаминные концентраты, аминокислоты, витамины, ферментные и другие препараты.

Разработка настоящих Методических указаний обусловлена расширяющимся промышленным применением микроорганизмов в различных отраслях народного хозяйства нашей страны и возникшей проблемой гигиенического регламентирования их содержания в воздухе рабочей зоны.

Настоящие Методические указания должны способствовать получению однородных и сравниваемых материалов, выбору оптимального объема исследований, необходимых для обоснования санитарных стандартов предельно допустимых концентраций для производственных штаммов микроорганизмов и на их основе готовых форм препаратов.

Регламентированию подлежат штаммы микроорганизмов, допущенные к использованию в технологических процессах микробиологического синтеза.

Последовательность проведения исследований, их объем, рекомендуемые методы и питательные среды, являясь обязательными, не должны связывать творческой инициативы научных коллективов и отдельных специалистов в плане расширения, углубления, привлечения и использования дополнительных и новых методов исследования при обосновании нормативов на промышленные микроорганизмы.

При направлении для исследования производственных штаммов микроорганизмов с целью обоснования их ПДК в воздухе рабочей зоны обязательно указывается полное наименование микроорганизма и его таксономическое положение, представляются сведения об условиях культивирования и областях применения. Если имеется наполнитель, то указывается какой, его дисперсность и какое количество микроорганизмов находится в 1 г готового продукта.

Исследования проводят на следующих видах животных: белые мыши (масса тела 18 - 24 г), белые крысы (масса тела 180 - 240 г), морские свинки (масса тела 200 - 250) и кролики (масса тела 1500 - 2000 г). При этом указывают вид, линию (популяцию), пол, исходную массу тела, пищевой рацион, сезон, в который производилась каждая серия экспериментов. Могут быть использованы и другие модели, применяемые в микробиологии: культура клеток, куриные эмбрионы и т.п. Выбор модели должен быть аргументирован.

Качество лабораторных животных должно соответствовать требованиям, изложенным в IX разделе Методических указаний "К постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (М., 1980); условия содержания - требованиям "Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)", (М., 1973).

Гигиеническому нормированию могут подвергаться не только отдельные штаммы микроорганизмов, но и группы штаммов, имеющие таксономическое родство и обладающие сходными показателями вирулентности. В таком случае проводится предварительный отбор группы штаммов микроорганизмов, подлежащих нормированию, т.е. выделение групповых репрезентативных штаммов, которые являются типичными представителями данной группы микроорганизмов. Групповые репрезентативные штаммы исследуются по полной схеме, а остальные представители такой группы исследуют только в остром опыте.

СПОСОБЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

              1. Определение средневирулентной дозы (ДV  )

                                                       50

   Определение   средневирулентной  дозы,   т.е.  дозы,  которая  вызывает

смертельный  эффект  у  50%  подопытных  животных,  проводят путем введения

                                    5    6    7    8    9     10

взвеси  штаммов  микроорганизмов  (10 , 10 , 10 , 10 , 10  и 10   клеток на

одно  животное)  внутрибрюшинно  и  в желудок. На каждую дозу используют не

менее  12 мышей и 12 крыс (по 6 самок и 6 самцов), и проводят наблюдение за

их   выживаемостью   и   общим   состоянием  в  течение  30  суток.  Расчет

средневирулентной дозы проводят статистическим методом.

2. Определение диссеминации штаммов микроорганизмов

во внутренних органах подопытных животных

С целью определения диссеминации во внутренних органах изучаемыми штаммами используют животных, оставшихся в живых от дозы с наибольшим числом введенных микроорганизмов. Время забора материала - через 12, 72 часа и месяц после введения культуры микроорганизма. На каждый срок контроля забивают не менее 6 животных (3 самца и 3 самки). Посевы делают из крови и отпечатки легких, сердца, печени, селезенки и почек. Посевы делают до прекращения обнаружения культуры микроорганизмов, но не более 1-го месяца.

3. Изучение способности штаммов микроорганизмов

повреждать конъюнктивальную оболочку глаза

Повреждающее действие штаммов микроорганизмов при их местном воздействии изучают на конъюнктивальной оболочке глаз кролика в два этапа:

а) воспалительное действие штаммов микроорганизмов;

б) раздражающее действие готовых форм препарата.

   Для  проведения  опыта  берут  не  менее  3-х  кроликов  на каждый этап

                                                                 9

исследования.   Из   взвеси,   в   1   мл   которой  находится  10   клеток

микроорганизмов,   закапывают  1  каплю  в  конъюнктивальный  мешок  глаза.

Внесение  капли производят однократно. Учет эффекта проводят в соответствии

с   "Методическими   указаниями   к  постановке  исследований  по  изучению

раздражающих   свойств   и   обоснованию   ПДК   избирательно   действующих

раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны" (N 2196-80 от 11.08.80).

В случае обнаружения местного действия на конъюнктиву глаза проводят исследование раздражающих или воспалительных свойств штаммов микроорганизмов с целью установления недействующего количества (концентрации) микроорганизмов или готовых препаратов на их основе.

4. Установление порога острого ингаляционного действия

Исследования проводят на наиболее чувствительных животных по результатам определения средневирулентной дозы при однократной четырехчасовой экспозиции. Минимальная группа животных - 12 особей. Обследование животных проводят через сутки после окончания затравки. В качестве показателей интоксикации используются интегральные (общее состояние, ректальная температура тела) и специфические показатели, характеризующие состояние организма (миграции клеточных элементов на поверхность слизистой оболочки верхних дыхательных путей и легких, способность изучаемого микроорганизма проникать в кровь из дыхательных путей, паранекротические изменения в легких).

5. Определение среднеаллергенной дозы

   Установление    среднеаллергенной    дозы    проводят    при   изучении

сенсибилизирующей  активности  штаммов  микроорганизмов  или  готовых  форм

препаратов,  получаемых   на   их  основе.  Выраженность  сенсибилизирующей

активности  учитывают  по  ДАI    -  среднеаллергенной  дозе,  под  которой

                             50

понимается  средняя  эффективная  доза,  вызывающая  изучаемый эффект у 50%

животных.  Определение  среднеаллергенной  дозы проводят следующим образом.

Вначале  в  кожу  наружной  поверхности  уха  морской  свинки  (не менее 12

животных) в 0,02 мл физиологического раствора вводят микроорганизмы в дозах

 2     3     4     5

10 ,  10 ,  10  и 10  на одно животное. Контрольным животным вводят 0,02 мл

физиологического раствора.

Через 10 суток после введения микроорганизмов в кожу наружной поверхности уха ставят внутрикожно пробы с аллергенами, которые вводят в кожу боковой поверхности туловища подопытных морских свинок в объеме 0,1 мл. Контрольным животным вводят в том же объеме растворитель, используемый для приготовления аллергена. Реакцию учитывают через 24 часа по диаметру эритемы и оценке инфильтрата или отека.

Реакцию оценивают в баллах:

1 балл - эритема;

2 балла - эритема и небольшой отек;

3 балла - выраженная инфильтрация;

4 балла - появление некроза.

Если введение контрольного физиологического раствора вызывает видимую реакцию кожи в те же сроки наблюдения, то аналогичные ей реакции на введение микроорганизмов оценивают как отрицательные.

Подбор разрешающей дозы для тестирования осуществляется однократным внутрикожным введением аллергена 5 - 6 интактным морским свинкам альбиносам. Для тестирования выбирают максимальное количество микроорганизмов, не вызвавших реакцию кожи через 24 часа после введения.

Метод гистаминовой провокации применяется в том случае, если внутрикожные пробы дали сомнительные результаты. С этой целью подопытным и контрольным животным внутрибрюшинно вводят дозу гистамина из расчета 0,03 мг/кг совместно с разрешающей дозой аллергена. Реакцию учитывают через 20 - 40 минут по гибели животных или характерным признакам сенсибилизации (почесывание лапками мордочки, почихивание, озноб и т.д.).

   Полученные результаты рассчитывают статистическим методом, устанавливая

при  этом  ДАI  .  В  качестве  альтернативного  учета реакции предлагается

             50

наличие   или   отсутствие   кожных   реакций,   при  тестировании  методом

гистаминовой   провокации   эффект   учитывается  по  гибели  животных  или

характерным признакам сенсибилизации.

             6. Определение опасности в условиях повторного

          ингаляционного воздействия штаммами микроорганизмов

              или готовыми формами препаратов на их основе

   Эксперимент    по   определению   опасности   в   условиях   повторного

ингаляционного воздействия штаммами  микроорганизмов   проводят  в  течение

4-х месяцев, при экспозиции 4 часа в  день,  5  раз  в  неделю  на  морских

свинках. Для установления среднеаллергенной концентрации (САI  )  и  порога

                                                            50

аллергенного  действия (Lim  ) при ингаляционном воздействии (через 1 месяц

                          al

после  начала  опыта)  отбирают  не менее 12 животных, которым  внутрикожно

вводят  разрешающую  пробу.  В  случае  неэффективности  разрешающей  пробы

используют метод гистаминовой провокации.

Из иммунологических методов оценки сенсибилизации рекомендуются реакция специфического лизиса лейкоцитов, реакция специфической агломерации лейкоцитов, а для определения гуморальных антител - реакция специфической микропреципитации.

Для возможности установления диссеминации микроорганизмов во внутренних органах морские свинки, находящиеся в хроническом эксперименте, обследуются через 3 суток первого, второго, третьего и четвертого месяцев после начала ингаляции. Обследование проводят и после окончания восстановительного периода.

В случае развития дисбактериоза под влиянием изучаемого микроорганизма проводят бактериологическое исследование испражнений, взятых из толстого кишечника животного. При этом в фекалиях определяют количество кишечных палочек (посев на среду Эндо), количество гемолитических бактерий (посев на 5% кровяной агар), энтерококков (на среде с ТТХ), стафилококков (посев на дрожжевой агар солевой - ДСА), грибов (на среде Сабуро), бактериоидов (на среде КАБ), лактобацилл (на среде Ленцнера), протея (посев на бульон с мочевиной).

Все посевы на аэробы инкубируют 24 - 48 часов при 37 °C, посевы на анаэробы инкубируют 24 - 48 часов в атмосфере углекислого газа при 37 °C. Определяют количество микроорганизмов в 1 г фекалий.

Наименьшее количество (концентрация) микроорганизмов, вызвавшее дисбактериоз, считается пороговой концентрацией при ингаляционном воздействии.

В те же сроки, когда проводится забой животных с целью определения диссеминации во внутренних органах, животных предварительно обследуют, используя интегральные показатели, характеризующие общее состояние (температура и масса тела, частота сердечных сокращений и другие). Из специфических показателей используют исследования, рекомендованные в пункте 4 настоящих указаний, при установлении порога острого ингаляционного действия.

7. Морфологические исследования

внутренних органов подопытных животных

Морфологические исследования внутренних органов подопытных и контрольных животных проводят по общепринятым методам с учетом воздействия микроорганизмов, обязательно при выполнении пунктов 1 и 6 настоящих Методических указаний.

8. Обоснование предельно допустимой концентрации

производственных штаммов микроорганизмов или готовых форм

препаратов на их основе

После получения результатов исследования и установления пороговых уровней, рассчитывается предельно допустимая концентрация как отношение пороговой концентрации по лимитирующему эффекту к коэффициенту запаса. Коэффициент запаса выбирается с учетом всех установленных показателей опасности, но не менее 10.

Класс опасности для штаммов микроорганизмов устанавливается в соответствии с классификацией штаммов микроорганизмов по степени опасности.

КЛАССИФИКАЦИЯ

ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО СТЕПЕНИ ОПАСНОСТИ

???????????????????????????????????????????????????????????????????????????

?Наимено- ?   Ед.   ?             Нормы для класса опасности              ?

?вание    ?измерения???????????????????????????????????????????????????????

?показа-  ?         ?   1-го   ?    2-го     ?     3-го     ?    4-го     ?

?теля     ?         ?          ?             ?              ?             ?

???????????????????????????????????????????????????????????????????????????

?Средняя  ?клеток   ?          ?             ?              ?             ?

?вирулент-?на одно  ?          ?             ?              ?             ?

?ная доза:?животное ?          ?             ?              ?             ?

?         ?         ?     7    ?     7      9?     9      11?        11   ?

?при      ?         ?до 10     ?от 10  до 10 ?от 10  до 10  ?более 10     ?

?введении ?         ?          ?             ?              ?             ?

?в желудок?         ?          ?             ?              ?             ?

?         ?         ?     5    ?     5      7?     7      9 ?        9    ?

?при      ?         ?до 10     ?от 10  до 10 ?от 10  до 10  ?более 10     ?

?введении ?         ?          ?             ?              ?             ?

?внутри-  ?         ?          ?             ?              ?             ?

?брюшинно ?         ?          ?             ?              ?             ?

???????????????????????????????????????????????????????????????????????????

?         ?         ?     2    ?     2      3?     3      4 ?        4    ?

?Средняя  ?клеток   ?до 10     ?от 10  до 10 ?от 10  до 10  ?более 10     ?

?аллерген-?на одно  ?          ?             ?              ?             ?

?ная доза ?животное ?          ?             ?              ?             ?

?по       ?         ?          ?             ?              ?             ?

?сенсиби- ?         ?          ?             ?              ?             ?

?лизирую- ?         ?          ?             ?              ?             ?

?щему     ?         ?          ?             ?              ?             ?

?эффекту  ?         ?          ?             ?              ?             ?

???????????????????????????????????????????????????????????????????????????

?         ?         ?     3    ?     3      4?     4      5 ?        5    ?

?Порог    ?кл/куб. м?до 10     ?от 10  до 10 ?от 10  до 10  ?более 10     ?

?аллерген-?         ?          ?             ?              ?             ?

?ного     ?         ?          ?             ?              ?             ?

?ингаля-  ?         ?          ?             ?              ?             ?

?ционного ?         ?          ?             ?              ?             ?

?действия ?         ?          ?             ?              ?             ?

???????????????????????????????????????????????????????????????????????????

?         ?         ?         3?         3   ?         4    ?            5?

?Порог    ?кл/куб. м?до 3 x 10 ?от 3 x 10    ?от 3 x 10     ?более 3 x 10 ?

?хроничес-?         ?          ?         4   ?         5    ?             ?

?кого     ?         ?          ?до 3 x 10    ?до 3 x 10     ?             ?

?ингаля-  ?         ?          ?             ?              ?             ?

?ционного ?         ?          ?             ?              ?             ?

?действия ?         ?          ?             ?              ?             ?

???????????????????????????????????????????????????????????????????????????

?ПДК      ?кл/куб. м?до 200    ?от 200       ?от 2000       ?более 20000  ?

?штаммов  ?         ?          ?до 2000      ?до 20000      ?             ?

?микро-   ?         ?          ?             ?              ?             ?

?организ- ?         ?          ?             ?              ?             ?

?мов в    ?         ?          ?             ?              ?             ?

?воздухе  ?         ?          ?             ?              ?             ?

?рабочей  ?         ?          ?             ?              ?             ?

?зоны     ?         ?          ?             ?              ?             ?

???????????????????????????????????????????????????????????????????????????

1-й класс - чрезвычайно опасные, обладают выраженным общетоксическим или аллергенным действием;

2-й класс - высокоопасные, могут оказывать сильное аллергенное и общетоксическое действие;

3-й класс - умеренные, обладают слабым общетоксическим или аллергенным действием;

4-й класс - малоопасные, практически не обладают аллергенным и общетоксическим действием.

Приложение

1. Приготовление взвеси

и количественный учет микроорганизмов

При проведении работ по исследованию штаммов микроорганизмов (острая токсичность, постановка внутрикожных проб, изучение местного действия, изготовление диагностических аллергенов) необходимо использовать односуточную (свежую) культуру микроба-продуцента.

Питательные среды для выращивания должны обеспечивать оптимальный рост высеваемой культуры. Полученную взвесь микроорганизмов центрифугируют не менее 2 - 3 раз в физиологическом растворе с целью удаления остатков питательной среды.

Приготовленную таким образом взвесь микроорганизмов используют для непосредственного введения животным.

Для подсчета количества микробных клеток в суспензии используют камеру Горяева-Тома или другие счетные камеры. Подсчет проводят следующим образом:

- шлифованное, плоскопараллельное покровное стекло притереть к сторонам камеры путем смещения его в противоположные стороны несколько раз. Наполнить камеру суспензией микробов. Используя объектив 8х или 40х проверить под микроскопом густоту суспензии. Если в большом квадрате более 20, а в малом более 10 клеток, развести суспензию. Подсчитать 150 - 200 клеток микроорганизма в 10 больших (или 20 маленьких) квадратах сетки, перемещая квадраты по диагонали. Учесть все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. Повторить процедуру еще два раза, готовя каждый раз из исследуемой суспензии новый препарат. Подсчитать за 2 раза 600 - 800 клеток. Определить количество клеток по формуле:

                                 a x 1000

                             M = -------- x n,

                                  h x S

где:

M - число клеток в 1 мл суспензии;

a - среднее число клеток в квадрате сетки (из трех повторностей);

h - глубина камеры (указана на предметном стекле клетки, равна 0,1 или 0,2 мм);

S - площадь квадрата сетки в кв. мм (в камере Горяева площадь большого квадрата равна 1/25 кв. мм, площадь малого 1/400 кв. мм); 1000 куб. мм = 1 мл;

n - разведение исходной суспензии.

Некоторые микроорганизмы можно подсчитать только при иммерсионном увеличении (90х). Для этого используют метод фиксированных мазков; с этой целью:

- отметить простым карандашом на миллиметровой бумаге прямоугольник в 4 кв. см;

- поместить на прямоугольник чистое, сухое обезжиренное стекло;

- нанести 0,02 или 0,05 мл суспензии микробов и каплю 0,03% водного раствора агара;

- петлей или краем покровного стекла равномерно распределить каплю по площади прямоугольника;

- подсушить мазок на воздухе, погрузить в стаканчик с 96° этанолом на 10 - 20 минут для фиксации мазка;

- окрасить мазок раствором фуксина Циля или генцианвиолета, нанеся несколько капель краски на поверхность мазка;

- через 1 - 2 минуты промыть мазок, последовательно погружая стекло в 4 - 5 стаканов с водой;

- высушить мазок на воздухе и подсчитать клетки с помощью окулярной сетки, которую для этого следует поместить в окуляр между собирательной и глазной линзой;

- подсчитать 150 - 200 клеток микроорганизма в 10 больших (или 20 маленьких) квадратах сетки, перемещая квадраты по диагонали. Учесть все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающую верхнюю и правую стороны квадрата. Повторить процедуру еще два раза, готовя каждый раз из исследуемой суспензии новый препарат. Подсчитать за 2 раза 600 - 800 клеток.

Количество микробных клеток в суспензии вычисляют по формуле:

                                  a x S

                              M = ----- x n,

                                  S x v

где:

M - количество клеток в 1 мл исходной суспензии;

a - среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (или в поле зрения);

S - площадь квадрата окулярной сетки (поле зрения) в кв. мк;

v - объем нанесенной на стекло суспензии в мл;

S - площадь приготовленного мазка в кв. мк;

n - разведение суспензии.

Площадь квадрата сетки или поля зрения определяют с помощью объект-микрометра. Последний помещают на столик микроскопа и при том же увеличении, при котором проводят подсчет, определяют сторону окулярной сетки или диаметр поля зрения. Площадь поля зрения вычисляется по формуле:

                                       2

                               S = пи r .

Для оценки жизнеспособных клеток необходимо приготовить раствор краски: 1) на растворе Рингера или Хенкса двойной концентрации приготовить 0,1% раствор водного эозина;

2) на дистиллированной воде приготовить 0,1% раствор трипановой синьки;

3) смешать растворы в отношении 1:1.

К капле микробной суспензии добавить 1 - 2 капли краски, смешать. Подсчитать в камере Горяева 100 клеток, среди них число окрашенных (мертвых), определить процент живых клеток.

2. Бактериологическое и гистологическое

исследование внутренних органов

Приготовление микроскопических материалов проводится с соблюдением мер и режима работы в асептических условиях.

Исследуемую кровь отбирают в местах ее наибольшего скопления пипеткой в количестве 0,1 мл и моментально наносят на предметное стекло и на поверхность питательной среды, по которой она равномерно распределяется шпателем (посев способом "газона").

Внутренние органы - легкие, почки, печень, селезенка и т.д. обрабатывают спиртом или прижигают их поверхности раскаленным металлическим шпателем и разрезают стерильным скальпелем. С поверхности разреза делают отпечатки на предметные стекла. Часть органа отсекают от остальной части и фиксируют в 10 - 15% растворе формалина в течение 24 - 48 часов. Другую часть органа подвергают измельчению и растирают в стерильной ступке с 1 - 2 мл стерильного физиологического раствора. После 5 минут отстаивания полученной кашицей засевают методом "газона" на питательную среду и помещают в термостат с оптимальной для искомого микроорганизма температурой.

   Для культивирования анаэробов - условия анаэробиоза в микроанаэростатах

                               -1

МИ-752 с остаточным давлением 10   мм ртутного столба.

Мазки на предметных стеклах (параллельно должны быть мазки и из исходной культуры исследуемого микроорганизма) просушивают на воздухе при комнатной температуре и фиксируют одним из известных способов:

- троекратным проведением предметного стекла с мазком-отпечатком вверх над пламенем, время фиксации не более 5 - 6 секунд;

- внесением предметного стекла с мазком-отпечатком в емкость с 96° этиловым спиртом на 10 - 15 минут;

- нанесением на мазок-отпечаток 1 - 2 капель жидкости Никифорова (смесь равных объемов этилового спирта и эфира), время фиксации 20 минут.

Для количественного учета микроорганизмов препарат окрашивают различными способами в зависимости от вида искомой культуры.

Приготовление гистологического материала:

Для изготовления гистологического среза фиксированный в 10 - 15% растворе формалина в течение 24 - 48 часов материал заливают парафином по принятой в патоморфологии методике.

Для окраски микроорганизмов в гистологических срезах (синька Лефлера, по Грам-Вейгерту, Гоммори-Гроккоту) следует срез депарафинировать. Удаление парафина из среза производится ксилолом на предметное стекло, на которое наклеивается срез или серия срезов, с помощью смеси белка с глицерином (готовой из равных частей чистого свежего куриного белка и глицерина, затем смесь фильтруют, добавляют кристаллик камфоры или тимола). С этой целью каплю белка глицерина размазывают тонким слоем на предметном стекле и фламбируют над пламенем со стороны необработанной поверхности. Затем на обработанную поверхность стекла наносят каплю дистиллированной воды и располагают парафиновый срез. Избыток воды сливают, а срез плотно прижимают к стеклу несколькими слоями фильтровальной бумаги, можно - смоченной 96° спиртом.

В полученных препаратах определяют форму микробов, размеры, расположение их группами или в одиночку, цепочкой или кучками, наличие или отсутствие спор, мицелия, псевдомицелия, результаты окраски по Граму (положительные, отрицательные) и т.д.

3. Методы приготовления микробных аллергенов

Приготовление корпускулярных антигенов. В чашку Петри с агаризованной средой положить диск из целлофана, вылить 1 мл стерильного фосфатного буфера и 2 - 3 капли микробной взвеси. Тщательно растереть шпателем. Чашки поместить на одни сутки в термостат при 37 °C. Затем микробную культуру смыть 1 - 5 мл физиологического раствора с 0,2 - 0,3 объемными процентами формалина. Полученную микробную взвесь проверяют на стерильность и разводят 0,25% стерильным карболовым физиологическим раствором до густоты 1 млрд. микробных клеток в мл, разливают в ампулы. Антиген проверяют на токсичность: вводят 0,5 мл внутрибрюшинно двум белым мышам и наблюдают за их состоянием в течение 7 суток. Если животные выживают, антиген считается безвредным.

Получение микробных белоксодержащих аллергенов методом щелочного экстрагирования. Микробную культуру выращивают на плотной питательной среде, смывают физиологическим раствором, центрифугируют и высушивают ацетоном. К сухой микробной массе прибавляют щелочь из расчета 50 мл 1% раствора КОН на 1 г микробов. Экстракцию проводят при комнатной температуре в течение 1 суток (периодически перемешивают). Осадок удаляют центрифугированием в течение 1 часа при 10 - 12 тысячах оборотов в минуту и температуре 5 °C. Экстракт осаждают 50% раствором уксусной кислоты, а надосадочную жидкость сливают (оставив 1/4 - 1/5 часть от исходного объема). Смесь выдерживают 2 часа при температуре 5 - 8 °C. Осадок отделяют центрифугированием в течение 30 минут при 4 - 6 тысячах об./мин., растворяют в физиологическом растворе (1/5 часть от исходного объема экстракта) и подщелачивают до pH 7,2 - 7,4. Подвергают диализу в течение 18 - 20 часов против водопроводной воды и 6 часов против дистиллированной воды. Проводят лиофильное высушивание. Полученный порошок запаивают в ампулы и хранят в холодильнике. Растворяя порошок в обратном буфере с pH 7,2 - 7,4, получают аллерген, который стандартизируют по содержанию белка и используют для кожных аппликационных проб.

Изготовление белоксодержащих грибковых аллергенов. Из целлофана (марки "пищевой-45") вырезают диски диаметром на 1 см больше чашки Петри и стерилизуют при 1 атмосфере 30 минут. Стерильные диски укладывают на чашки Петри со средой Чапека или сусло-агаром. На целлофан наливают 1 мл стерильного фосфатного буфера и засевают грибы. Чашки помещают в термостат (28 - 30 °C) на 8 - 10 суток. Выращенные культуры грибов смывают с целлофана, фильтруют через 2 слоя стерильной марли и высушивают при 60 °C в течение 72 часов (со 100 чашек получают 15 - 18 г сухого вещества).

5 г сухого вещества (спор) заливают 100 мл экстрагирующей жидкости Эвенса-Кока с этанолом (12% спирта в конечной концентрации). Жидкость Эвенса-Кока готовят из следующих компонентов: реактив N 1 - натрий хлористый 50 г, калий фосфорнокислый однозамещенный 365 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 14,31 г, дистиллированная вода - до 1 литра; реактив N 2 - 4% раствор фенола. Равные объемы реактивов N 1 и 2 смешивают и к 1 части смеси прибавляют 4 части дистиллированной воды, pH жидкости соответствует 7,0 - 7,2.

Экстракцию проводят в банке с притертой крышкой при постоянном встряхивании в холодильнике в течение 11 суток. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр, стерилизуют, пропуская через фильтр Зейтца, разливают в ампулы. Затем проверяют на стерильность и безвредность: белым мышам или морским свинкам вводят внутривенно или внутрибрюшинно в дозах 10 мг/кг и наблюдают 30 суток. Определяют содержание общего и белкового азота по методу микро-Къельдаля.

4. Количественное определение штаммов-микроорганизмов

в воздухе затравочных камер

Отбор проб воздуха из камер производится прибором Кротова с переходным приспособлением следующим образом:

- предварительно чашки Петри заливают соответствующей питательной средой на строго горизонтальном столе, наливая в каждую чашку по 15 мл питательной среды;

- по истечении времени, необходимого для отбора воздуха (проведения "посева"), чашки с "посевом" инкубируют 24 - 48 часов при температуре, соответствующей оптимальной температуре исследуемого штамма микроорганизма. Чашки просматривают и подсчитывают общее количество выросших, идентичных исследуемому штамму, колоний. Зная количество воздуха, проходящего через прибор в минуту, и время экспозиции, определяют общий объем воздуха, из которого произведен высев. По количеству выросших в чашке Петри колоний определяют концентрацию микроорганизмов в 1 куб. м воздуха.

Пример подсчета:

Через прибор пропущено 60 л воздуха в течение 2 мин., число выросших колоний - 120, тогда количество микроорганизмов в 1 куб. м воздуха будет равно:

       120 x 1000

   x = ---------- = 2000.

           60

5. Определение способности микроорганизмов проникать

в кровь из дыхательных путей

Для определения способности изучаемого микроорганизма проникать в кровь из дыхательных путей у каждого животного (не менее 12) берут по 2 капли крови из хвостовой артерии через час после окончания экспозиции и через сутки. Полученную кровь наносят на твердые или жидкие питательные среды. Методы посева и подсчета микроорганизмов описаны выше.

6. Регистрация паранекротических изменений в легких

После постановки кожных проб (у тех же животных) о развитии паранекротических изменений в легких судят по способности ткани легкого фиксировать краситель.

Морским свинкам, крысам внутрисердечно вводят нейтральный краситель в количестве 0,2 мл на 100 г массы тела. Раствор 1% нейтрального красителя приготавливается на физиологическом растворе перед употреблением. Краска подогревается до 100 °C в течение 30 мин. Время введения краски отмечается по секундомеру. Животные забиваются пересечением позвоночника со стороны спины, чтобы не повредить трахею и исключить попадание крови в легкие, через 1 и 10 мин. после инъекции. После забоя животных вскрывают и извлекают легкие; 500 мг ткани легкого погружают в герметично закрытый бюкс, содержащий 5 мл 1% солянокислого спирта. Кусочек легкого измельчают в бюксе кончиками острых ножниц, через 24 часа раствор сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют. Определение количества красителя производят на ФЭКе при зеленом светофильтре (546 - 550 нм).