Про затвердження методик виконання вимірювань медико-біологічних показників

За даними АКТ у процентному вираженні на міліметровому папері накреслюють аутокоагулограму і визначають такі її параметри (Рис. 1):

Рис.1 Вихідна частина кривої АКТ відображає динаміку наростання і максимальну активність (МА) тромбопластину і тромбіну в крові, що досліджується, при стандартизованій активації процесу зсідання. Низхідна частина кривої характеризує швидкість і інтенсивність інактивації тромбіну. Якщо дослідника цікавить лише величина максимальної тромбопластин-тромбінової активності крові, АКТ може виконуватися в скороченому варіанті, що зменшує час дослідження і втрату крові хворого. Так, для контролю за лікуванням гепарином достатньо дослідити згортальну активність лише на 10-й хв інкубації ГКС, для виявлення гіперкоагуляції на 4, 6, 8, 10 хвилинах, для діагностики гемофілії на 10, 20, 30 хвилинах.

А2 згортальна активність на 2-й хв [норма 15,4 ? 2,9 %]. Цей параметр найбільш мінливий, оскільки відбиває найперші етапи утворення тромбопластину та тромбіну в ГКС.

МА максимальна сідаюча активність [норма 100,0 ? 1.1 %]

Т1 час досягнення половини МА [норма 3,7 ? 0,2 хв]

Т2 час досягнення МА [норма 10 хв]

ІТ індекс інактивації тромбопластину, який обчислюють за формулою:             

ІТ = МА / ЗА 60,

де ЗА 60 згортальна активність на 60 хв. інкубації. Норма: [2,1 ? 0,1].

Таблиця 4

10.1 За результат вимірювання приймають середнє значення (хср, с.) двох паралельних вимірювань, яке розраховується за формулою:

хср=(х1 + х2)/2,

де х1, х2 значення, отримані у двох паралельних вимірюваннях.

10.2  Результати вимірювань заносяться до облікової медичної документації, затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.01 №1:

•  форма 237/о “Аналіз крові (показники системи згортання)”;
•  форма 238/о -  “Аналіз крові (показники системи згортання скорочений варіант”;
•  форма 250/о “Журнал реєстрації аналізів і їх результатів”;
•  форма 262/о “Журнал обліку аналізів, зроблених в лабораторії”.

11 КОНТРОЛЬ ПОХИБКИ ВИМІРЮВАНЬ

11.1 Визначення систематичної похибки вимірювань за даною методикою проводиться методом паралельних проб. Для цього проводять по два паралельних вимірювання 10 проб пацієнтів поточного дня.

11.2 Вимірювання  часу зсідання плазми крові в тесті АКТ проводять відповідно до розділу 9.

11.3 Отримані дані заносять у таблицю 4.

Таблиця 4.

11. 4 За отриманими результатами вимірювань розраховується середнє значення показників (п.10.1), середньоквадратичне відхилення (?) та коефіцієнт варіації (V). Результати розрахунків порівнюються з величинами, наведеними в таблиці 1 розділу 2.

11.5 Будують контрольну карту кумулятивних сум.

11.6 Кожного дня різницю між двома паралельними вимірюваннями проб, відмічають на карті. Результати, які попадають за межі контрольних вимірювань (2?) вказують на наявність недоліків в системі вимірювання.

11.7 Якщо отримані результати вимірів не відповідають вимогам розділу 2 та п.11.6, то виміри необхідно повторити.

11.8 Якщо результати повторного контролю незадовільні, то виконання вимірювань необхідно припинити, виявити та усунути причини, які до цього призвели.

12. ПОСИЛАННЯ НА НОРМАТИВНІ ДОКУМЕНТИ

МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ

ВИМІРЮВАННЯ ВМІСТУ ФАКТОРА VIII В ПЛАЗМІ КРОВІ ЛЮДИНИ

МВВ 42.01-20-2002

Київ

ГАРМОНІЗОВАНО:

1 Герасименко Т.І.

2 Герцюк М.М.

3 Катаєва Л.М

4.Крицька С.П.

5.Лунева А.Г.

6 Платонова Т.М.

7.Осипчук К.Й.

8.Федорова І.Р.

Відтворювати, тиражувати і розповсюджувати цей документ повністю чи частково на будь-яких носіях інформації без офіційного дозволу МОЗ України заборонено.

1 ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ

Документ встановлює порядок виконання вимірювання вмісту фактору VIII в плазмі крові людини.

Методика призначена для використання у закладах охорони здоровя.

2 ХАРАКТЕРИСТИКА ПОХИБКИ ВИЗНАЧЕННЯ

Методика забезпечує вимірювання вмісту фактору VIII в плазмі крові людини за характеристиками, наведеними у таблиці 1.

         Таблиця 1

3 ЗАСОБИ ВИМІРЮВАЛЬНОЇ ТЕХНІКИ, ДОПОМІЖНЕ ОБЛАДНАННЯ, РЕАКТИВИ І МАТЕРІАЛИ

3.1 Ваги 2 кл. точності ГОСТ 24104-88Е

3.2 Важки лабораторні 2 кл. точності ГОСТ 7328-82Е

3.3 Баня водяна лабораторна ТУ 64-1-2850-80

3.4 Дозатори медичні лабораторні ГОСТ 28311-89

3.5 Іономір ЕВ-74 ТУ25-05. 2147-78

3.6 Мішалка магнітна

3.7 Секундомір механічний ТУ 25-1819. 0021-90

3.8 Термометр скляний ртутний для точних вимірювань ГОСТ 13646-68

3.9 Центрифуга ЦЛР-1 ТУ 5. 375-4215-77

3.10 Колби мірні місткістю від 100,0 до 1000.0 мл ГОСТ 1770-74

3.11 Пробірки мірні лабораторні місткістю 10 мл ТУ 98-891-021-91Е

3.12 Пробірки поліетиленові місткістю (10-15) мл ТУ 208 УССР 273-84

3.13 Флакони з притертим корком ТУ 64-2-407-89

3.14 Циліндри ГОСТ 1770-74

3.15 Папір білогарифмічний

3.16 Вода дистильована ГОСТ 6709-79

3.17 Кальцій хлористий ГОСТ 4161-77

3.18 Каолін ГФХ, с.140

3.19 Кислота диетилбарбітурова  

3.20 Натрій 5,5-диетилбарбітуровокислий (медінал) ТУ 6-09-2082-78

3.21 Натрій лимоннокислий 5,5 водний ГОСТ 22280-76

3.22 Натрій гідроцитрат

3.23 Натрій хлористий ГОСТ 4233-77

3.24 Еритрофосфатид

Всі засоби вимірювальної техніки повинні бути атестовані та повірені у встановленому порядку. Допускається застосування іншого обладнання, лабораторного посуду, а також реактивів і матеріалів з метрологічними та технічними характеристиками не нижчими, ніж наведені.

4 МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ

Метод визначення  вмісту фактора VIII модифікованим одноступінчатим каолін-кефаліновим методом базується на використанні субстрат-плазми з різким дефіцитом антигемофільного глобуліну (АГГ) але з нормальним вмістом усіх інших факторів зсідання крові. Для отримання оптимального середовища, в якому визначають кількість АГГ, крім субстрат-плазми використовують каолін та  еритрофосфатид.

5 ВИМОГИ ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ

При виконанні вимірювань необхідно дотримуватись вимог НАОП 1.3.10-1.06-77 “Загальні правила безпеки роботи в хімічних лабораторіях”, затверджених 27.07.77 Мінхімпромом СРСР: НАОП 1.1.10-1.01-85 “Правила техніки безпеки при експлуатації електроустановок”, затверджено 10.09.85 Міненерго СРСР та ЦК галузевої профспілки; правил безпеки роботи, що представлені в експлуатаційній документації на засоби вимірювальної техніки та допоміжні пристрої.

6 ВИМОГИ ДО КВАЛІФІКАЦІЇ ВИКОНАВЦЯ

До виконання методики допускаються спеціалісти із спеціальною освітою, які відповідають кваліфікаційним вимогам  відповідно до наказів МОЗ України від 19.12.97 №359, від 23.10.91 №146, та пройшли курси з клінічної лабораторної діагностики у державних навчальних закладах освіти системи МОЗ України різного рівня акредитації, наукових закладах або таких, що до них прирівняні, і мають право видавати документи державного зразка згідно з чинним законодавством України.

7 УМОВИ ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ

При проведені вимірювань повинні бути забезпечені наступні умови:

7.1 Температура середовища (22±5) оС.

7.2 Відносна вологість від  60% до 75%.

7.3 Атмосферний тиск від 84,0 до 106,7 кПа (від 600,0 до 800,3 мм рт.ст).

7.4 Напруга електромережі (220±22) В.

7.5 Освітленість від 300 до 400 лк.

8 ПІДГОТОВКА ДО ВИЗНАЧЕННЯ

8.1 Усі прилади, засоби вимірювальної техніки та допоміжне обладнання привести у робочий стан згідно з інструкціями по експлуатації.

8.2 Приготування розчинів

8.2.1 Приготування буферу барбіталово-солевого рН= (7,5±0,05).

Наважки (2,06±0,01) г натрію 5,5-диетилбарбітуровокислого (п. 3.20), (2,76±0,01) г кислоти диетилбарбітурової  (п. 3.19) та (7,30±0,01) г натрію хлористого (п. 3.23) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.10), розчиняють у дистильованій воді (п.3.16) та доводять обєм розчину до мітки. рН буферу перевіряють на іонометрі універсальному (п. 3.5). Буфер зберігають у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.13) протягом місяця при температурі від 4 до 8 0 С.

8.2.2 Приготування розчину натрію хлористого з концентрацією 8,5 г/л .

Наважку (8,50±0,01) г натрію хлористого (п. 3.23) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.10), розчиняють у дистильованій воді (п. 3.16) і доводять обєм розчину до мітки. Розчин зберігають у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.13) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 0С.

8.2.3 Приготування розчину натрію лимоннокислого (гідроцитрату) (2,0 г на 100 г розчину).

Наважку (2,00±0,01) г натрію лимоннокислого (п. 3.22) розчиняють у 98,0 мл дистильованої води (п. 3.16), яку відміряють циліндром (п. 3.14). Розчин зберігають при температурі від 4 до 6 0С протягом одного тижня.

8.2.4 Приготування розчину натрію лимоннокислого 5,5 водного (3,8 г на 100 г розчину).

Наважку (3,80±0,01) г натрію лимоннокислого (п. 3.21) розчиняють у 96,2 мл дистильованої води (п. 3.16), яку відміряють циліндром (п. 3.14). Розчин зберігають при температурі від 4 до 6 0С протягом одного тижня.

8.2.5 Приготування розчину кальцію хлористого 0,033 моль/л .

Наважку (3,70±0,01) г кальція хлористого зневодненого (п. 3.17) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.10) та розчиняють у дистильованій воді (п. 3.16), обєм розчину доводять до мітки. Розчин зберігають у флаконах темного скла з притертим корком (п. 3.13) при температурі від 4 до 6 0С протягом місяця.

8.2.6 Приготування каолін - еритрофосфатидної суміші.

2,5-3,0 % емульсію еритрфосфатиду (п. 3.24) розбавляють фізіологічним розчином (п. 8.2.2) до 0,1 % емульсії, розфасовують по 1 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.12), герметично закупорюють і зберігають при температурі мінус 20 0С один рік.

Перед роботою емульсію еритрфосфатиду розморожують, розбавляють до концентрації 0,01% фізіологічним розчином (п. 8.2.2) у співвідношенні (1:9) та додають (5,0±0,1) мг каоліну (п. 3.18) на 1 мл емульсії еритрфосфатиду. Суміш перемішують на магнітній мішалці (п.3.6) (або вручну) при кімнатній температурі  для отримання рівномірної суміші.

Каолін-еритрофосфатидну суміш зберігати під час досліду у бані крижаній водяній. Суміш стабільна при температурі від 4 до 6 0С протягом 48 годин.

8.3 Одержання стандартної донорської плазми крові.

Кров у донора беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким діаметром, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають. Під час взяття крові не рекомендується накладати джгут і робити масаж передпліччя для запобігання активації зсідання крові і фібринолізу.

У пробірку   поліетиленову (п. 3.12) дозатором  лабораторним (п. 3.4) вносять  0,3-0,5 мл розчину натрію лимоннокислого 5,5 водного (п. 8.2.4) та змішують відповідно з 2,5-4,5 мл крові. Пробірку з сумішшю щільно закривають корком і повільними рухами обережно декілька разів перемішують (не струшуючи).

Центрифугують (п. 3.9) протягом 20 хв з прискоренням 1200-1400 g при температурі 4 0С. Плазму крові переносять дозатором лабораторним (п. 3.4) у пробірку поліетиленову (п. 3.12).

Для приготування стандартної донорської плазми крові необхідно змішати у рівних співвідношеннях плазму крові 7-10 донорів. Отриману стандартну плазму розфасувати по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.12), заморозити та зберігати протягом  5-7 днів при температурі мінус 20 0 С.  

Безпосередньо перед виконанням вимірювань плазму крові розморожують у бані водяній лабораторній (п. 3.3) при 37 ?С. Після відтаювання плазма повинна бути прозорою.

Вимоги до зразків плазми крові установлюються у розділах преаналітики посібників з клінічної лабораторної діагностики.

8.4 Приготування  плазми крові, що досліджується.

Кров хворого з невідомим вмістом фактору VIII стабілізують розчином натрію лимоннокислого 5,5 водного (п. 8.2.4) у співвідношенні 1:9 і центрифугують у тих же умовах, що і стандартну плазму.

При необхідності плазму розфасовують по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.10), зберігають при температурі -20?С.

8.5 Одержання субстратної плазми крові хворих на гемофілію.

Субстратну плазму отримують з крові хворих тяжкою формою гемофілії А, у якій вміст фактору VIII варіює у межах 1-3 %. При підборі субстратної плазми показником її якості є дані часу зсідання, що отримані у тих же умовах досліду, які застосовуються для визначення вмісту фактора VIII, за виключенням того, що розведену стандартну плазму замінюють рівною кількістю (0,1 мл) барбіталового буферу (п. 8.2.1). Час зсідання плазми  крові хворого на гемофілію у межах 120-135 с вказує на придатність її для використання як субстратну плазму крові.

. Кров хворого стабілізують 2 % розчином натрію  гідроцитрату (п. 8.2.3)  у розведенні 1:4.  Центрифугують (п. 3.9) при температурі 4 ?С протягом 20 хв з прискоренням 1200-1400 g. Плазму крові переносять дозатором лабораторним (п. 3.4) у пробірку поліетиленову (п. 3.10) і повторно центрифугують при тих же умовах для повного видалення клітин крові. Потім дозатором лабораторним (п.3.4) плазму розфасовують по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.10), зберігають при температурі -20?С.

Субстрат-плазма є придатною для визначення вмісту фактору VIII при зберіганні протягом 2-3 місяців.

9 ХІД ВИЗНАЧЕННЯ

9.1 Розчини кальцію хлористого (п.8.2.5) поміщають у баню водяну лабораторну і залишають на весь час роботи при температурі 37 0С.

9.2 Стандартну (п. 8.3), досліджувану (п. 8.4), субстратну ( п. 8.5) плазму крові та каолін-еритрофосфатидну суміш (п. 8.2.6) зберігають під час досліду у бані водяній крижаній.

9.3 Перевірка активності каолінеритрофосфатидної суміші (п. 8.2.6).

Кожного дня перед початком титрування фактора VIII необхідно перевіряти відповідність реагента каолінеритрофосфатидної суміші (п. 8.2.6). вимогам методу. Для цього визначають час зсідання стандартної плазми у розведенні 1:9.

9.3.1 В пробірку мірну лабораторну (п. 3.11) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,1 мл каолінеритрофосфатидної суміші (п. 8.2.6); 0,1 мл субстратної плазми (п. 8.5) і 0,1 мл розведеної в 10 разів  стандартної донорської плазми (п. 8.3) перемішують і інкубують протягом шести хв (час, достатній для повної активації факторів контакту) при температурі 37 °С на бані водяній лабораторній (п. 3.3).

9.3.2 Через шість хв додають 0,1 мл 0,033 моль/л розчину кальцію хлористого (п. 8.2.5) і  включають секундомір (п. 3.7). Пробірки з реагентами через кожні 1-2 секунди нахиляють на 45 градусів і визначають час утворення згустку, який є критерієм закінчення реакції.

За умовами, прийнятими для даної модифікації методу, час зсідання стандартної плазми крові в розведенні 1:9 повинен бути постійним і дорівнювати 65 с, що досягається за рахунок зміни концентрації еритрофосфатиду (змінюючи його вміст у суміші з каоліном, у межах 0,2-0,075 мг/мл).

При визначенні стандартної точки (65 с) є необхідним співпадання значень двох паралельних проб.

9.4 Визначення вмісту фактору VIII в плазмі крові хворого.

В пробірку мірну лабораторну (п. 3.11) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,1 мл каолінеритрофосфатидної суміші (п. 8.2.6), 0,1 мл субстратної плазми крові (п. 8.5), і 0,1 мл розведеної в 10 разів плазми крові, що досліджується (п. 8.4) перемішують і інкубують протягом 6 хв (час, достатній для повної активації факторів контакту) при температурі 37 °С на бані водяній лабораторній (п. 3.3).

Через 6 хв додають 0,1 мл 0,033 моль/л розчину кальцію хлористого (п. 8.2.5) і одночасно включають секундомір (п. 3.7). Пробірки з реагентами через кожні 1-2 секунди нахиляють на 45 градусів і визначають час утворення згустку, який є критерієм закінчення реакції.

Визначають вміст фактору VIII в плазмі крові за градуювальним графіком або за даними таблиці 2.

9.5 Побудова градуювального графіка

Градуювальний графік будують на білогарифмічному папері (п. 3.25), використовуючи розведення стандартної донорської плазми крові барбіталовим  буфером у співвідношенні 1:9, 1:19, 1:39, 1:79, 1:159, 1:319 (тобто в 10, 20, 40, 80, 160, 320 разів). Кожне наступне розведення готують із попереднього безпосередньо перед використанням. При правильному визначенні отримані експериментальні значення для кожного розведення стандартної плазми накладаються на теоретично розраховану пряму (відхилення у межах 0-3,8%).

Коагуляційну активність розведеної у співвідношенні (1:9) стандартної донорської плазми крові приймають за 100 %. Концентрація фактору у наступних розведеннях   відповідає 50; 25; 12,5; 6,25 та 3,125  %.

При побудові  градуювального графіка до 0,1 мл кожного розведення стандартної донорської плазми крові (референтної плазми крові) дозатором лабораторним (п.3.4) додають 0.1 мл субстратної плазми (п. 8.5) і поміщають у баню водяну лабораторну при температурі 37 0С.

До суміші плазм дозатором лабораторним (п. 3.4) додають 0,1 мл каолін-еритрофосфатидної суміші та інкубують протягом 6 хв при температурі 37 0С.  

Через 6 хв додають 0,1 мл 0,033 моль/л розчину кальцію хлористого (п. 8.2.5) і одночасно включають секундомір (п. 3.7). Пробірки з реагентами через кожні 1-2 секунди нахиляють на 45 градусів і визначають час утворення згустку.

Використовуючи отримані дані будують градуювальний графік: на вертикальній осі відкладають час згортання зразків, що досліджувались, а на горизонтальній осі процент активності фактору VIII ( за 100 приймають активність фактору VIII в стандартній донорській плазмі, яка розведена в 10 разів).

Розрахунок концентрації фактору VIII можна вести за таблицею, яка складена на основі даних, що отримуються при титруванні різних розведень стандартної донорської плазми крові з відомим вмістом фактору VIII .

Екстраполюючи дані часу зсідання з інтервалом в 1 секунду на пряму, що отримана на подвійній логарифмічній шкалі, визначають відповідні їм концентрації фактора VIII у процентах, що представлені у таблиці 2:

Вміст АГГ у плазмі можна розрахувати не тільки в процентах, а і в одиницях активності за наступною формулою:

                               вміст фактора VIII в %  х  Обєм плазми, що досліджується            

Вміст фактора =                                               

активності                                                          100

За 1 одиницю активності АГГ приймають кількість фактора VIII у плазмі 100% активності.

Нормальні величини складають 50-200%, в середньому - 100%.

10 ОБРОБКА ТА ОФОРМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ВИМІРЮВАНЬ

10.1 За результат вимірювання приймають середнє значення (хср, с) двох паралельних вимірювань, яке розраховується за формулою:

хср=(х1 + х2)/2,

де х1, х2 значення, отримані у двох паралельних вимірюваннях.

10.2  Результати вимірювань заносяться до облікової медичної документації, затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.01 №1:

•  форма 237/о “Аналіз крові (показники системи згортання)”;
•  форма 238/о -  “Аналіз крові (показники системи згортання скорочений варіант”;
•  форма 250/о “Журнал реєстрації аналізів і їх результатів”;
•  форма 262/о “Журнал обліку аналізів, зроблених в лабораторії”.

11 КОНТРОЛЬ ПОХИБКИ ВИМІРЮВАНЬ

11.1 Визначення систематичної похибки вимірювань за даною методикою проводиться методом паралельних проб. Для цього проводять по два паралельних вимірювання 10 проб пацієнтів поточного дня.

11.2 Вимірювання  вмісту фактору VIII в плазмі крові проводять відповідно до розділу 9.

11.3 Отримані дані заносять у таблицю 3.

Таблиця 3.

11. 4 За отриманими результатами вимірювань розраховується середнє значення показників (п.10.1), середньоквадратичне відхилення (?) та коефіцієнт варіації (V). Результати розрахунків порівнюються з величинами, наведеними в таблиці 1 розділу 2.

11.5 Будують контрольну карту кумулятивних сум.

11.6 Кожного дня різницю між двома паралельними вимірюваннями проб, відмічають на карті. Результати, які попадають за межі контрольних вимірювань (2?) вказують на наявність недоліків в системі вимірювання.

11.7 Якщо отримані результати вимірів не відповідають вимогам розділу 2 та п.11.6, то виміри необхідно повторити.

 11.8 Якщо результати повторного контролю незадовільні, то виконання вимірювання необхідно припинити, виявити та усунути причини, які до цього призвели.

12. ПОСИЛАННЯ НА НОРМАТИВНІ ДОКУМЕНТИ

Міністерство охорони здоровя України

МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ

ВИМІРЮВАННЯ ЧАСУ ЗСІДАННЯ ПЛАЗМИ КРОВІ ЛЮДИНИ В ТЕСТІ РЕПТИЛАЗНИЙ ЧАС

МВВ 42.01-21-2002

Київ

ГАРМОНІЗОВАНО:

1 Герасименко Т.І.

2 Герцюк М.М.

3 Катаєва Л.М

4.Крицька С.П.

5.Лунева А.Г.

6 Платонова Т.М.

7.Осипчук К.Й.

8.Федорова І.Р.

Відтворювати, тиражувати і розповсюджувати цей документ повністю чи частково на будь-яких носіях інформації без офіційного дозволу МОЗ України заборонено.

1 ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ

Документ встановлює методику виконання вимірювання часу зсідання плазми крові в тесті рептилазний (РЧ). Визначення РЧ може виконуватися при використанні розчину тромбіноподібного ферменту з стандартною активністю.

Методика призначена для використання у закладах охорони здоровя.

2 ХАРАКТЕРИСТИКА ПОХИБКИ ВИЗНАЧЕННЯ

Методика забезпечує вимірювання часу зсідання плазми крові в тесті рептилазний час (РЧ) за характеристиками, наведеними у таблиці 1.

         Таблиця 1

3 ЗАСОБИ ВИМІРЮВАЛЬНОЇ ТЕХНІКИ, ДОПОМІЖНЕ ОБЛАДНАННЯ, РЕАКТИВИ І МАТЕРІАЛИ

3.1 Ваги 2 кл. точності ГОСТ 24104-88Е

3.2 Важки лабораторні 2 кл. точності ГОСТ 7328-82Е

3.3 Баня водяна лабораторна ТУ 64-1-2850-80

3.4 Дозатори медичні лабораторні ГОСТ 28311-89

3.5 Іонометр ЕВ-74 ТУ25-05. 2147-78

3.6 Секундомір механічний ТУ 25-1819. 0021-90

3.7 Термометр скляний ртутний для точних вимірювань ГОСТ 13646-68

3.8 Центрифуга ЦЛР-1 ТУ 5. 375-4215-77

3.9 Колби мірні місткістю від 100,0 до 1000.0 мл ГОСТ 1770-74

3.10 Пробірки мірні лабораторні місткістю 10 мл ТУ 98-891-021-91Е

3.11 Пробірки поліетиленові місткістю (10-15) мл ТУ 208 УССР 273-84

3.12 Флакони з притертим корком ТУ 64-2-407-89

3.13 Циліндри ГОСТ 1770-74

3.14 Вода дистильована ГОСТ 6709-79

3.15 Натрій 5,5-диетилбарбітуровокислий (медінал) ТУ 6-09-2082-78

3.16 Натрій лимоннокислий 5,5 водний  ГОСТ 22280-76

3.17 Натрій хлористий ГОСТ 4233-773

3.18 Рептилаза

3.19 Фіксанал кислоти соляної ГОСТ3118-77

Всі засоби вимірювальної техніки повинні бути повірені у встановленому порядку. Допускається застосування іншого обладнання, лабораторного посуду, а також реактивів і матеріалів з метрологічними та технічними характеристиками не нижчими, ніж наведені.

4 МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ

Метод базується на визначенні часу зсідання плазми крові при додаванні розчину тромбіноподібного ферменту рептилази, який має стандартну активність. Рептилазний час не подовжується при введенні гепарину.

5 ВИМОГИ ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ

При виконанні вимірювань необхідно дотримуватись вимог НАОП 1.3.10-1.06-77 “Загальні правила безпеки роботи в хімічних лабораторіях”, затверджених 27.07.77 Мінхімпромом СРСР: НАОП 1.1.10-1.01-85 “Правила техніки безпеки при експлуатації електроустановок”, затверджено 10.09.85 Міненерго СРСР та ЦК галузевої профспілки; правил безпеки роботи, що представлені в експлуатаційній документації на засоби вимірювальної техніки та допоміжні пристрої.

6 ВИМОГИ ДО КВАЛІФІКАЦІЇ ВИКОНАВЦЯ

До виконання методики допускаються спеціалісти із спеціальною освітою, які відповідають кваліфікаційним вимогам  відповідно до наказів МОЗ України від 19.12.97 №359, від 23.10.91 №146, та пройшли курси з клінічної лабораторної діагностики у державних навчальних закладах освіти системи МОЗ України різного рівня акредитації, наукових закладах або таких, що до них прирівняні, і мають право видавати документи державного зразка згідно з чинним законодавством України.

7 УМОВИ ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ

При проведені вимірювань повинні бути забезпечені наступні умови:

7.1 Температура середовища (22±5) оС.

7.2 Відносна вологість від 60% до 75%.

7.3 Атмосферний тиск від 84,0 до 106,7 кПа (від 600,0 до 800,3 мм рт.ст).

7.4 Напруга електромережі (220±22) В.

7.5 Освітленість від 300 до 400 лк.

8 ПІДГОТОВКА ДО ВИЗНАЧЕННЯ

8.1 Усі прилади, засоби вимірювальної техніки та допоміжне обладнання привести у робочий стан згідно з інструкціями по експлуатації.

8.2 Приготування розчинів

8.2.1 Приготування буферу Міхаеліса  рН= (7,35±0,05).

Розчин А. Наважку (20,60±0,01) г натрію 5,5-диетилбарбітуровокислого (п. 3.15) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), розчиняють у дистильованій воді (п.3.14) і обєм розчину доводять до мітки. Розчин зберігається у флаконах з темного скла з притертим корком (п.3.12) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 0С.

Розчин Б. Фіксанал кислоти соляної 0,1 моль/л (п. 3.19) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9) і обєм розчину доводять до мітки дистильованою водою (п. 3.14). Розчин зберігається у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.12) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 0С.

Розчин В. Наважку (7,30±0,001) г натрію хлористого (п. 3.17) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), відміряють циліндром (п. 3.13) 290 мл розчину А і 210 мл  розчину Б, додають в колбу та обєм доводять до мітки. рН буферу перевіряють на іонометрі універсальному (п. 3.5). Буфер зберігають у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.12) протягом місяця при температурі від 4 до 8 0 С.

8.2.2 Приготування розчину фізіологічного з концентрацією натрію хлористого 8,5 г/л.

Наважку (8,50±0,01) г натрію хлористого (п. 3.17) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), розчиняють у дистильованій воді (п. 3.14) і доводять обєм розчину до мітки. Розчин зберігається у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.12) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 0С.

8.2.3 Приготування розчину забуференого фізіологічного, рН = (7,4±0,1)..

Змішують 4 обєми розчину натрію хлористого (8,5 г/л ) (п. 8.2.2) з 1 обємом буферу Міхаеліса (п. 8.2.1). Зберігати розчин при температурі від 4 до 8 0 С протягом місяця.

8.2.4 Приготування розчину лимоннокислого натрію (3,8 г на 100 г розчину).

Наважку (3,80±0,01) г натрію лимоннокислого (п. 3.16) розчиняють у 96,2 мл дистильованої води (п. 3.14), яку відміряють циліндром (п.3.13). Розчин зберігають при температурі від 4 до 6 0С протягом одного тижня.

8.2.5 Приготування розчину рептилази.

Приготування розчину рептилази (п. 3.18) проводять відповідно до інструкції фірми, яка випускає препарат. Час зсідання контрольної плазми крові в тесті за 14-15 секунд.

8.3 Одержання плазми крові.

Кров у хворого беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким діаметром, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають. Під час взяття крові не рекомендується накладати джгут і робити масаж передпліччя для запобігання активації зсідання крові і фібринолізу.

У пробірку поліетиленову (п. 3.11) дозатором  лабораторним (п. 3.4) вносять 0,3-0,5 мл розчину натрію лимоннокислого (п. 8.2.4) та змішують відповідно з 2,5-4,5 мл крові. Пробірку з сумішшю щільно закривають корком і повільними рухами обережно декілька разів перемішують (не струшуючи).

Центрифугують (п. 3.8) протягом 10 хв з прискоренням 1200-1400 g. Плазму крові переносять дозатором лабораторним (п. 3.4) у пробірку поліетиленову (п. 3.11). 

Вимоги до зразків плазми крові установлюються у розділах преаналітики посібників з клінічної лабораторної діагностики.

8.4 Одержання стандартної донорської плазми крові.

Для приготування стандартної донорської  плазми крові необхідно змішати у рівних співвідношеннях плазму крові більш ніж 7 донорів, отриману, як вказано в п.8.4, розфасувати по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.11), заморозити та зберігати протягом двох тижнів при температурі мінус 20 0 С.

9 ХІД ВИЗНАЧЕННЯ

9.1 В пробірку  мірну лабораторну (п. 3.10) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,1 мл плазми, що досліджується (п. 8.3), 0,1 мл забуференого фізіологічного розчину (п. 8.2.3) і поміщають пробірку у баню водяну лабораторну (п. 3.3) при температурі 37 0С.

9.2 Через 10-15 с додають 0,1 мл розчину рептилази (п. 8.2.5) та включають секундомір (п. 3.6). Пробірки з реагентами через кожні 1-2 секунди нахиляють на 45 градусів і визначають час утворення згустку, який є критерієм закінчення реакції.

Час зсідання стандартної донорської плазми крові складає 13-15 с. Рептилазний час вважають подовженим, якщо порівняно з нормою він збільшується більше, ніж на пять секунд.

10 ОБРОБКА ТА ОФОРМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ВИМІРЮВАНЬ

10.1 За результат вимірювання приймають середнє значення (хср, c) двох паралельних вимірювань, яке розраховується за формулою:

хср=(х1 + х2)/2,

де х1, х2 значення, отримані у двох паралельних вимірюваннях.

10.2  Результати вимірювань заносяться до облікової медичної документації, затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.01 №1:

•  форма 237/о “Аналіз крові (показники системи згортання)”;
•  форма 238/о -  “Аналіз крові (показники системи згортання скорочений варіант”;
•  форма 250/о “Журнал реєстрації аналізів і їх результатів”;
•  форма 262/о “Журнал обліку аналізів, зроблених в лабораторії”.

11 КОНТРОЛЬ ПОХИБКИ ВИМІРЮВАНЬ

11.1 Визначення систематичної похибки вимірювань за даною методикою проводиться методом паралельних проб. Для цього проводять по два паралельних вимірювання 10 проб пацієнтів поточного дня.

11.2 Вимірювання  часу зсідання плазми крові в тесті рептилазний час  проводять відповідно до розділу 9.

11.3 Отримані дані заносять у таблицю 2.

Таблиця 2.

11. 4  За отриманими  результатами вимірювань розраховується середнє значення показників (п.10.1), середньоквадратичне відхилення (?) та коефіцієнт варіації (V). Результати розрахунків порівнюються  з величинами, наведеними в таблиці 1 розділу 2.

11.5 Будують контрольну карту кумулятивних сум.

11.6 Кожного дня різницю між двома паралельними вимірюваннями проб, відмічають на карті. Результати, які попадають за межі контрольних вимірювань (2?) вказують на наявність недоліків в системі вимірювання.

11.7  Якщо отримані результати вимірів не задовольняють вимоги розділу 2 та п.11.6, то виміри необхідно повторити.

11.8 Якщо результати повторного контролю незадовільні, то виконання вимірювань необхідно припинити, виявити та усунути причини, які до цього призвели.

12. ПОСИЛАННЯ НА НОРМАТИВНІ ДОКУМЕНТИ

Міністерство охорони здоровя України

МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ

ВИМІРЮВАННЯ АКТИВНОСТІ ПЛАЗМІНУ ПЛАЗМИ КРОВІ ЛЮДИНИ

МВВ 42.01-22-2002

Київ

ГАРМОНІЗОВАНО:

1 Герасименко Т.І.

2 Герцюк М.М.

3 Катаєва Л.М

4.Крицька С.П.

5.Лунева А.Г.

6 Платонова Т.М.

7.Осипчук К.Й.

8.Федорова І.Р.

Відтворювати, тиражувати і розповсюджувати цей документ повністю чи частково на будь-яких носіях інформації без офіційного дозволу МОЗ України заборонено.

1 ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ

Документ встановлює порядок виконання вимірювання рівню активності плазміну в плазмі крові.

Методика призначена для використання у закладах охорони здоровя.

2 ХАРАКТЕРИСТИКА ПОХИБКИ ВИЗНАЧЕННЯ

Методика забезпечує вимірювання рівню активності плазміну в плазмі крові  за характеристиками, наведеними у таблиці 1.

         Таблиця 1

3 ЗАСОБИ ВИМІРЮВАЛЬНОЇ ТЕХНІКИ, ДОПОМІЖНЕ ОБЛАДНАННЯ, РЕАКТИВИ І МАТЕРІАЛИ

3.1 Ваги 2 кл. точності ГОСТ 24104-88Е

3.2 Важки лабораторні 2 кл. точності ГОСТ 7328-82Е

3.3 Баня водяна лабораторна ТУ 64-1-2850-80

3.4 Дозатори медичні лабораторні ГОСТ 28311-89

3.5 Іономір ЕВ-74 ТУ25-05. 2147-78

3.6 Мішалка магнітна ГОСТ

3.7 Секундомір механічний ТУ 25-1819. 0021-90

3.8 Спектрофотометр СФ-46 ТУ 3-3 1841-84

3.9 Термометр скляний ртутний для точних вимірювань ГОСТ 13646-68

3.10 Фотоелектрокалориметр ФЕК-М 2 ТУ 3-3 1766-82

3.11 Центрифуга ЦЛР-1 ТУ 5. 375-4215-77

3.12 Шприц

3.13 Колби мірні місткістю від 100,0 до 1000.0 мл ГОСТ 1770-74

3.14 Пробірки мірні лабораторні місткістю 10 мл ТУ 98-891-021-91Е

3.15 Пробірки поліетиленові місткістю (10-15) мл ТУ 208 УССР 273-84

3.16 Стакани скляні лабораторні ГОСТ 1770-74

3.17 Флакони з притертим корком ТУ 64-2-407-89

3.18 Циліндри ГОСТ 1770-74

3.19 Вата

3.20 Азофібрин (суспензія )

3.21 Вода дистильована ГОСТ 6709-793.15

3.22 Натрій їдкий ГОСТ 11078-78

3.23 Натрій гідрофосфорнокислий ГОСТ 4172-76

3.24 Натрій дигідрофосфорнокислий ГОСТ 245-76

3.25 Натрій лимонокислий 5,5 водний ГОСТ 22280-76

3.26 Натрій хлористий ГОСТ 4233-77

3.27 Стрептокіназа

Всі засоби вимірювальної техніки повинні бути атестовані та повірені у встановленому порядку. Допускається застосування іншого обладнання, лабораторного посуду, а також реактивів і матеріалів з метрологічними та технічними характеристиками не нижчими, ніж наведені.

4 МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ

Метод визначення фібринолітичної активності плазми крові базується на визначенні ступеню розщеплення азофібрину плазміном, що присутній в плазмі крові (або плазміногеном, який активовано стрептокіназою).

Вміст плазміну визначається по розщепленню азофібрину до активації плазми крові стрептокіназою.

Вміст плазміногену визначається за різницею між фібринолітичною активністю плазми крові після активації та до активації стрептокіназою.

5 ВИМОГИ ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ

При виконанні вимірювань необхідно дотримуватись вимог НАОП 1.3.10-1.06-77 “Загальні правила безпеки роботи в хімічних лабораторіях”, затверджених 27.07.77 Мінхімпромом СРСР: НАОП 1.1.10-1.01-85 “Правила техніки безпеки при експлуатації електроустановок”, затверджено 10.09.85 Міненерго СРСР та ЦК галузевої профспілки; правил безпеки роботи, що представлені в експлуатаційній документації на засоби вимірювальної техніки та допоміжні пристрої.

6 ВИМОГИ ДО КВАЛІФІКАЦІЇ ВИКОНАВЦЯ

До виконання методики допускаються спеціалісти із спеціальною освітою, які відповідають кваліфікаційним вимогам  відповідно до наказів МОЗ України від 19.12.97 №359, від 23.10.91 №146, та пройшли курси з клінічної лабораторної діагностики у державних навчальних закладах освіти системи МОЗ України різного рівня акредитації, наукових закладах або таких, що до них прирівняні, і мають право видавати документи державного зразка згідно з чинним законодавством України.

7 УМОВИ ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ

При проведені вимірювань повинні бути забезпечені наступні умови:

7.1 Температура середовища (22±5) оС.

7.2 Відносна вологість від  60% до 75%.

7.3 Атмосферний тиск від 84,0 до 106,7 кПа (від 600,0 до 800,3 мм рт.ст).

7.4 Напруга електромережі (220±22) В.

7.5 Освітленість від 300 до 400 лк.

8 ПІДГОТОВКА ДО ВИЗНАЧЕННЯ

8.1 Усі прилади, засоби вимірювальної техніки та допоміжне обладнання привести у робочий стан згідно з інструкціями по експлуатації.

8.2 Приготування розчинів.

8.2.1 Приготування 5 М розчину натру їдкого

Наважку (10,00±0,01) г натру їдкого (п.3. 22) розчиняють в стакані в 30-40 мл дистильованої води ( п. 3.21), залишають при кімнатній температурі до повного охолодження. Переносять у мірну колбу місткістю 50,0 мл (п.3.13), доводять дистильованою водою (п. 3.21) до мітки. Розчин зберігають у флаконах темного скла (п. 3.17) протягом 3-4 тижнів.

8.2.2 Приготування 0,05 М натрій-фосфатного буферу, що містить 0,15 г/л  натрію хлориду рН (7,4±0,05).

Розчин А. Наважку (3,56±0,01) г натру гідрофосфорнокислого (п.3. 23) переносять в мірну колбу обємом 100,0 мл (п.3.13) та розчиняють .в дистильованій воді ( п. 3.21),  обєм доводять до мітки. Розчин зберігають у флаконах темного скла (п. 3.17) протягом 3-4 тижнів.

Розчин В. Наважку (3,12±0,01) г натру дигідрофосфорнокислого (п.3. 24) переносять в мірну колбу обємом 100,0 мл (п.3.13) та розчиняють .в дистильованій воді ( п. 3.21), обєм доводять до мітки. Розчин зберігають у флаконах темного скла (п. 3.17) протягом 3-4 тижнів.

Розчин С. 81,0 мл розчину А та 19,0 мл розчину В змішують у стакані (п.3.16), додають наважку натрію хлористого (3,50±0,01) г. Суміш переносять в циліндр (п.3.18) обємом 500,0 мл. Обєм буферу доводять до 400 мл дистильованою водою (п.3.21). На іонометрі (п.3.5) контролюють рН розчину. Розчин зберігати при температурі від 4 до 6 0С протягом одного місяця у флаконах темного скла з притертим корком (п.3.17).

8.2.3 Приготування розчину стрептокінази 10000 МО/мл.

Стрептокіназу (п.3.27)розчиняють у дистильованій воді з урахуванням активності препарату.

8.2.4 Приготування розчину натрію лимоннокислого (3,8 г на 100 г розчину).

Наважку (3,80±0,01) г натрію лимоннокислого (п. 3.26) розчиняють у 96,2 мл дистильованої води (п. 3.21), яку відміряють циліндром (п. 3.18). Розчин зберігають при температурі від 4 до 6 0С протягом одного тижня.

8.3 Одержання плазми крові.

Кров у хворого беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким діаметром, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають. Під час взяття крові не рекомендується накладати джгут і робити масаж передпліччя для запобігання активації зсідання крові і фібринолізу.

У пробірку поліетиленову п. 3.15) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,3-0,5 мл розчину натрію лимоннокислого 5,5 водного (п. 8.2.4) та змішують відповідно з 2,5-4,5 мл крові. Пробірку з сумішшю щільно закривають корком і повільними рухами обережно декілька разів перемішують (не струшуючи).

Центрифугують (п. 3.11) протягом 10 хв з прискоренням 1200-1400 g. Плазму крові переносять дозатором лабораторним (п. 3.4) у пробірку поліетиленову (п. 3.15).

Вимоги до зразків плазми крові установлюються у розділах преаналітики посібників з  клінічної лабораторної діагностики.

8.4 Одержання стандартної донорської плазми крові.

Для приготування стандартної донорської плазми крові необхідно змішати у рівних співвідношеннях плазму крові більш ніж 7 донорів, отриману, як вказано в п. 8.3, розфасувати по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.15), заморозити та зберігати протягом двох тижнів при температурі мінус 20 0 С.

Безпосередньо перед виконанням вимірювань плазму крові розморожують у бані водяній лабораторній (п. 3.3) при 37 ?С (до повного розморожування пробірку не струшувати). Після розморожування плазму перемішати, вона повинна бути прозорою.

9 ХІД ВИЗНАЧЕННЯ

9.1 У три пробірки (п. 3.14) вносять по 10 мг азофібрину (п. 3.20) і додають дозатором лабораторним (п. 3.4) у першу і третю пробірки по 0,85 мл, а у другу 0,7 мл натрій-фосфатного буфера (п. 8.2.2). Потім у першу і другу пробірки вносять дозатором лабораторним (п. 3.4) по 0,15 мл плазми крові, що досліджується, після чого у другу пробірку додають 0,15 мл розчину стрептокінази (п. 8.2.3).

9.2 Пробірки з сумішами інкубують на бані водяній лабораторній (п. 3.3) при температурі 37 ?С протягом 1 години. Час інкубації перевіряють за секундоміром (п. 3.7). Кожні 15-20 хвилин інкубації вміст пробірок обережно перемішують, не допускаючи налипання субстрату на стінки пробірки вище рівня наповнення.

9.3 Після інкубації у всі три пробірки дозатором лабораторним (п.3.4) додають по 3 мл дистильованої води (п. 3.21), а в третю (контрольну)- додатково 0,15 мл плазми крові, що досліджується.

9.4 Вміст пробірок швидко фільтрують через тонкий шар вати (п. 3.19), що знаходиться в шприці (п.3.12), продавлюючи його поршнем. Фільтрати збирають у пробірки (п. 3.14)  і додають до них дозатором лабораторним (п. 3.4) 0,05 мл 5М розчину їдкого натру (п. 8.2.1). Після перемішування миттєво виникає інтенсивне забарвлення від оранжевого до червоного. Інтенсивність забарвлення фільтратів проб (першої і другої пробірок) вимірюють порівняно з контролем (третя пробірка) на спектрофотометрі (п. 3. 8) при довжині хвилі 440 нм або на фотоелектрокалориметрі ФЕК-М (п. 3.10) із світлофільтром №3 (синім) при довжині оптичного шляху 1 см.

Розрахунок здійснюють за формулами:

Пн=Е1К1;  Пр=(Е2-Е1)?К2,

Де Пн і Пр - вміст плазміну і плазміногену відповідно (%);

Е1 і Е2 поглинання (оптична густина) фільтрату відповідно в першій і другій пробірці;

К1 і К2 розрахункові коефіцієнти, виведені для кожної серії субстрату при дослідженні пулу плазми здорових донорів. При цьому вміст плазміну і плазміногену в плазмі крові здорових донорів приймають за 100%.

10 ОБРОБКА ТА ОФОРМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ВИМІРЮВАНЬ

10.1 За результат вимірювання приймають середнє значення (хср, %) двох паралельних вимірювань, яке розраховується за формулою:

хср=(х1 + х2)/2,

де х1, х2 значення, отримані у двох паралельних вимірюваннях.

10.2  Результати вимірювань заносяться до облікової медичної документації, затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.01 №1:

•  форма 237/о “Аналіз крові (показники системи згортання)”;
•  форма 238/о -  “Аналіз крові (показники системи згортання скорочений варіант”;
•  форма 250/о “Журнал реєстрації аналізів і їх результатів”;
•  форма 262/о “Журнал обліку аналізів, зроблених в лабораторії”.

11 КОНТРОЛЬ ПОХИБКИ ВИМІРЮВАНЬ

11.1 Визначення систематичної похибки вимірювань за даною методикою проводиться методом паралельних проб. Для цього проводять по два паралельних вимірювання 10 проб пацієнтів поточного дня.

11.2 Вимірювання активності плазміну плазми крові проводять відповідно до розділу 9.

11.3 Отримані дані заносять у таблицю 3.

Таблиця 3.

11. 4 За отриманими результатами вимірювань розраховується середнє значення показників (п.10.1), середньоквадратичне відхилення (?) та коефіцієнт варіації (V). Результати розрахунків порівнюються з величинами, наведеними в таблиці 1 розділу 2.

11.5 Будують контрольну карту кумулятивних сум.

11.6 Кожного дня різницю між двома паралельними вимірюваннями проб, відмічають на карті. Результати, які попадають за межі контрольних вимірювань (2?) вказують на наявність недоліків в системі вимірювання.

11.7 Якщо отримані результати вимірів не відповідають вимогам розділу 2 та п.11.6, то виміри необхідно повторити.

11.8 Якщо результати повторного контролю незадовільні, то виконання вимірювання необхідно припинити, виявити та усунути причини, які до цього призвели.

12. ПОСИЛАННЯ НА НОРМАТИВНІ ДОКУМЕНТИ

Міністерство охорони здоровя України

МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ

ВИМІРЮВАННЯ ЧАСУ РЕТРАКЦІЇ ЗГУСТКІВ КРОВІ

МВВ 42.01-23-2002

Київ

ГАРМОНІЗОВАНО:

1 Герасименко Т.І.

2 Герцюк М.М.

3 Катаєва Л.М

4.Крицька С.П.

5 Лунева А.Г.

6 Платонова Т.М.

7 Осипчук К.Й.

8 Федорова І.Р.

Відтворювати, тиражувати і розповсюджувати цей документ повністю чи частково на будь-яких носіях інформації без офіційного дозволу МОЗ України заборонено.

1 ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ

Цей документ встановлює порядок виконання вимірювання ретракції згустку крові.

Методика призначена для використання у закладах охорони здоровя.

2 ХАРАКТЕРИСТИКА ПОХИБКИ ВИЗНАЧЕННЯ

Методика забезпечує виконання вимірювання ретракції згустку нестабілізованої венозної крові за характеристиками, наведеними у таблиці 1.

Таблиця 1.

3 ЗАСОБИ ВИМІРЮВАЛЬНОЇ ТЕХНІКИ, ДОПОМІЖНЕ ОБЛАДНАННЯ, РЕАКТИВИ І  МАТЕРІАЛИ

3.1 Баня водяна лабораторна ТУ 64-1-2850-80

3.2 Секундомір механічний ТУ 25-1819. 0021-90

3.3 Термометр скляний ртутний для точних вимірювань ГОСТ 13646-68

3.4 Центрифуга ЦЛР-1 ТУ 5 375-4215-77

3.5 Пробірки центрифужні мірні обємом 10 мл NE 98-891021-91-Е

3.6 Палички скляні діаметром 0,3-0,4 мм ГОСТ 1770-74

Всі засоби вимірювальної техніки повинні бути повірені у встановленому порядку. Допускається застосування іншого обладнання, лабораторного посуду, а також реактивів і матеріалів з метрологічними та технічними характеристиками не нижчими, ніж наведені.

4 МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ

Метод виконання вимірювання ретракції згустку крові базується на вимірюванні обєму сироватки, що виділяється при ретракції.

5 ВИМОГИ ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ

При виконанні вимірювань необхідно дотримуватись вимог НАОП 1.3.10-1.06-77 “Загальні правила безпеки роботи в хімічних лабораторіях”, затверджених 27.07.77 Мінхімпромом СРСР: НАОП 1.1.10-1.01-85 “Правила техніки безпеки при експлуатації електроустановок”, затверджено 10.09.85 Міненерго СРСР та ЦК галузевої профспілки; правил безпеки роботи, що представлені в експлуатаційній документації на засоби вимірювальної техніки та допоміжні пристрої.

6 ВИМОГИ ДО КВАЛІФІКАЦІЇ ВИКОНАВЦЯ

До виконання методики допускаються спеціалісти із спеціальною освітою, які відповідають кваліфікаційним вимогам  відповідно до наказів МОЗ України від 19.12.97 №359, від 23.10.91 №146, та пройшли курси з клінічної лабораторної діагностики у державних навчальних закладах освіти системи МОЗ України різного рівня акредитації, наукових закладах або таких, що до них прирівняні, і мають право видавати документи державного зразка згідно з чинним законодавством України.

7 УМОВИ ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ

При проведені вимірювань повинні бути забезпечені наступні умови:

7.1 Температура середовища (22±5) оС.

7.2 Відносна вологість від  60% до 75%.

7.3 Атмосферний тиск від 84,0 до 106,7 кПа (від 600,0 до 800,3 мм рт.ст).

7.4 Напруга електромережі (220±22) В.

7.5 Освітленість від 300 до 400 лк.

8 ПІДГОТОВКА ДО ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ

Кров у хворого беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким просвітом, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають. Під час взяття крові не рекомендується накладати джгут і робити масаж передпліччя для запобігання активації зсідання крові і фібринолізу.

9 ХІД ВИМІРЮВАННЯ

9.1 1 мл венозної крові відразу після взяття вміщують у градуйовану центрифужну мірну пробірку (п.3. 5), що вкрита сіліконом. У пробірку обережно вводять скляну паличку (п.3. 6 ), яку встановлюють у вертикальному положенні. Пробірку встановлюють на водяній бані ( п. 3. 1 ) при температурі +37?С до настання повного зсідання крові.

9.2 Через 1 год після зсідання крові скляну паличку обережно видаляють разом із згустком, а рідину центрифугують за допомогою центрифуги (п.3. 4 ) при 300 g протягом 5 хв.

9.3 Обєм сироватки, що залишилася, а також обєм клітин визначають за поділками на пробірці.

Розраховують ретракцію згустку за формулою:

                                                А

Ретракція згустку =   -----------------------  ?  100 %

                                                 В

де А - обєм сироватки, який виміряється по різниці між обємом рідини, що залишилася в пробірці та обємом еритроцитів.

В загальний обєм сироватки крові, що досліджується  (визначається з урахуванням гематокріту крові).

Ретракція кровяного згустку коливається в межах 48-60%.

Недостатня ретракція спостерігається при виражених тромбоцитопеніях, деяких видах якісної неповноцінності кровяних пластинок.

Несправжньо завищена ретракція спостерігається при анеміях і зниженні гематокритного показника. При гіпофібриногенемії згусток малий і це призводить до несправжнього завищення показника ретракції ( навіть у тому випадку, коли остання знижена).

10 ОБРОБКА ТА ОФОРМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ВИМІРЮВАНЬ

10.1 За результат вимірювання приймають середнє значення (хср, %) двох паралельних вимірювань, яке розраховується за формулою:

хср=(х1 + х2)/2,

де х1, х2 значення, отримані у двох паралельних вимірюваннях.

10.2 Результати вимірювань заносяться до облікової медичної документації, затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.01 №1:

•  форма 237/о “Аналіз крові (показники системи згортання)”;
•  форма 238/о -  “Аналіз крові (показники системи згортання скорочений варіант”;
•  форма 250/о “Журнал реєстрації аналізів і їх результатів”;
•  форма 262/о “Журнал обліку аналізів, зроблених в лабораторії”.

11 КОНТРОЛЬ ПОХИБКИ ВИМІРЮВАНЬ

11.1 Визначення систематичної похибки вимірювань за даною методикою проводиться методом паралельних проб. Для цього проводять по два паралельних вимірювання 10 проб пацієнтів поточного дня.

11.2 Вимірювання  ретракція згустку крові проводять відповідно до розділу 9.

11.3 Отримані дані заносять у таблицю 3.

Таблиця 3.

11.4 За отриманими результатами вимірювань розраховується середнє значення показників (п. 10.1), середньоквадратичне відхилення (?) та коефіцієнт варіації (V). Результати розрахунків порівнюються з величинами, наведеними в таблиці 1 розділу 2.

11.5 Будують контрольну карту кумулятивних сум.

11.6 Кожного дня різницю між двома паралельними вимірюваннями проб, відмічають на карті. Результати, які попадають за межі контрольних вимірювань (2?) вказують на наявність недоліків в системі вимірювання.

11.7  Якщо отримані результати вимірів не задовольняють вимоги розділу 2 та п.11.6, то виміри необхідно повторити.

11.8 Якщо результати повторного контролю незадовільні, то виконання вимірювань необхідно припинити, виявити та усунути причини, які до цього призвели.

12. ПОСИЛАННЯ НА НОРМАТИВНІ ДОКУМЕНТИ

Міністерство охорони здоровя України

МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ

ВИМІРЮВАННЯ АКТИВНОСТІ АНТИПЛАЗМІНУ ПЛАЗМИ КРОВІ ЛЮДИНИ

МВВ 42.01-24-2002

Київ

ГАРМОНІЗОВАНО:

1 Герасименко Т.І.

2 Герцюк М.М.

3 Катаєва Л.М

4.Крицька С.П.

5.Лунева А.Г.

6 Платонова Т.М.

7.Осипчук К.Й.

8.Федорова І.Р.

Відтворювати, тиражувати і розповсюджувати цей документ повністю чи частково на будь-яких носіях інформації без офіційного дозволу МОЗ України заборонено.

1 ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ

Документ встановлює порядок виконання вимірювання рівню активності антиплазміну в плазмі крові.

Методика призначена для використання у закладах охорони здоровя.

2 ХАРАКТЕРИСТИКА ПОХИБКИ ВИЗНАЧЕННЯ

Методика забезпечує вимірювання рівню активності антиплазміну в плазмі крові за характеристиками, що наведені у таблиці 1.

Таблиця 1

3 ЗАСОБИ ВИМІРЮВАЛЬНОЇ ТЕХНІКИ, ДОПОМІЖНЕ ОБЛАДНАННЯ, РЕАКТИВИ І МАТЕРІАЛИ

3.1 Ваги 2 кл. точності ГОСТ 24104-88Е

3.2 Важки лабораторні 2 кл. точності ГОСТ 7328-82Е

3.3 Баня водяна лабораторна ТУ 64-1-2850-80

3.4 Дозатори медичні лабораторні ГОСТ 28311-89

3.5 Іономір ЕВ-74 ТУ25-05. 2147-78

3.6 Мішалка магнітна ГОСТ

3.7 Секундомір механічний ТУ 25-1819. 0021-90

3.8 Спектрофотометр СФ-46 ТУ 3-3 1841-84

3.9 Термометр скляний ртутний для точних вимірювань ГОСТ 13646-68

3.10 Фотоелектрокалориметр ФЕК-М 2 ТУ 3-3 1766-82

3.11 Центрифуга ЦЛР-1 ТУ 5. 375-4215-77

3.12 Шприц

3.13 Колби мірні місткістю від 100,0 до 1000.0 мл ГОСТ 1770-74

3.14 Палички скляні діаметром 0,3-0,4 мм ГОСТ 1770-74

3.15 Пробірки мірні лабораторні місткістю 10 мл ТУ 98-891-021-91Е

3.16 Пробірки поліетиленові місткістю (10-15) мл ТУ 208 УССР 273-84

3.17 Флакони з притертим корком ТУ 64-2-407-89

3.18 Циліндри ГОСТ 1770-74

3.19 Вата

3.20 Азофібрин (суспензія )

3.21 Вода дистильована ГОСТ 6709-793.15

3.22 Натрій їдкий ГОСТ 11078-78

3.23 Натрій гідрофосфорнокислий ГОСТ 4172-76

3.24 Натрій дигідрофосфорнокислий ГОСТ 245-76

3.25 Натрій хлористий ГОСТ 4233-77  

3.26 Плазмін

3.27 Натрій лимоннокислий 5,5 водний ГОСТ 22280-76

Всі засоби вимірювальної техніки повинні бути атестовані та повірені у встановленому порядку. Допускається застосування іншого обладнання, лабораторного посуду, а також реактивів і матеріалів з метрологічними та технічними характеристиками не нижчими, ніж наведені.

4 МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ

Метод визначення рівню антиплазміну в плазмі крові базується на визначенні залишкової активності плазміну, який додається до плазми крові, що досліджується. Ступінь інактивації плазміну залежить від кількості інгібіторів (антиплазмінів) у плазмі.

5 ВИМОГИ ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ

При виконанні вимірювань необхідно дотримуватись вимог НАОП 1.3.10-1.06-77 “Загальні правила безпеки роботи в хімічних лабораторіях”, затверджених 27.07.77 Мінхімпромом СРСР: НАОП 1.1.10-1.01-85 “Правила техніки безпеки при експлуатації електроустановок”, затверджено 10.09.85 Міненерго СРСР та ЦК галузевої профспілки; правил безпеки роботи, що представлені в експлуатаційній документації на засоби вимірювальної техніки та допоміжні пристрої.

6 ВИМОГИ ДО КВАЛІФІКАЦІЇ ВИКОНАВЦЯ

До виконання методики допускаються спеціалісти із спеціальною освітою, які відповідають кваліфікаційним вимогам  відповідно до наказів МОЗ України від 19.12.97 №359, від 23.10.91 №146, та пройшли курси з клінічної лабораторної діагностики у державних навчальних закладах освіти системи МОЗ України різного рівня акредитації, наукових закладах або таких, що до них прирівняні, і мають право видавати документи державного зразка згідно з чинним законодавством України.

7 УМОВИ ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ

При проведені вимірювань повинні бути забезпечені наступні умови:

7.1 Температура середовища (22±5) оС.

7.2 Відносна вологість від  60% до 75%.

7.3 Атмосферний тиск від 84,0 до 106,7 кПа (від 600,0 до 800,3 мм рт.ст).

7.4 Напруга електромережі (220±22) В.

7.5 Освітленість від 300 до 400 лк.

8 ПІДГОТОВКА ДО ВИЗНАЧЕННЯ

8.1 Усі прилади, засоби вимірювальної техніки та допоміжне обладнання привести у робочий стан згідно з інструкціями по експлуатації.

8.2 Приготування розчинів.

8.2.1 Приготування 5 М розчину натру їдкого

Наважку (200,00±0,01) г натру їдкого (п.3. 22) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п.3.13), розчиняють у дистильованій воді (п. 3.21) і обєм доводять до мітки. Розчин зберігають у флаконах темного скла (п. 3.17) протягом 3-4 тижнів.

8.2.2 Приготування 0,05 М натрій-фосфатного буферу, що містить 0,15 г/л  натрію хлориду  рН (7,4±0,05).

8.2.3 Приготування розчину плазміну

0,2 мл розчину плазміну (п. 3.26), що відповідає 3,5 АО/мл; 2,5 мг білка/мл.

АО - одиниця активності плазміну за лізисом азофібрину. Одна АО дорівнює такій кількості плазміну, яка дає приріст оптичної густини, що становить одиницю за одну годину.

8.2.4 Приготування розчину натрію лимоннокислого (3,8 г на 100г розчину).

Наважку (3,80±0,01) г натрію лимоннокислого (п. 3.27) розчиняють у 96,2 мл дистильованої води (п. 3.21), яку відміряють циліндром (п. 3.18). Розчин зберігають при температурі від 4 до 6 0С протягом одного тижня.

8.3 Одержання плазми крові.

Кров у хворого беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким діаметром, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають. Під час взяття крові не рекомендується накладати джгут і робити масаж передпліччя для запобігання активації зсідання крові і фібринолізу.

У пробірку поліетиленову (п. 3.16) дозатором лабораторним п. 3.4)   вносять 0,3-0,5 мл розчину натрію лимоннокислого 5,5 водного (п. 8.2.4) та змішують відповідно з 2,5-4,5 мл крові. Пробірку з сумішшю щільно закривають корком і повільними рухами обережно декілька разів перемішують (не струшуючи).

Центрифугують (п. 3.11) протягом 10 хв з прискоренням 1200-1400 g. Плазму крові переносять дозатором лабораторним (п. 3.4) у пробірку поліетиленову (п. 3.16).

Вимоги до зразків плазми крові установлюються у розділах преаналітики посібників з  клінічної лабораторної діагностики.

8.4 Одержання стандартної донорської плазми крові.

Для приготування стандартної донорської плазми крові необхідно змішати у рівних співвідношеннях плазму крові більш ніж 7 донорів, отриману, як вказано в п. 8.3, розфасувати по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.16), заморозити та зберігати протягом двох тижнів при температурі мінус 20 0 С.

Безпосередньо перед виконанням вимірювань плазму крові розморожують у бані водяній лабораторній (п. 3.3) при 37 ?С (до повного відтаювання пробірку не струшувати). Після відтаювання плазма повинна бути  прозорою.

9 ХІД ВИЗНАЧЕННЯ

9.1 Інкубаційну суміш готують у пробірці мірній лабораторній (п. 3.15), в яку переносять наважку (5,00±0,01) мг азофібрину (п.3.20). Дозатором лабораторним (п.3.4) додають 1 мл розчину плазміну (п.8.2.3), який містить 10-100 його мікрограм.

9.2 До суміші додають 0,2 мл плазми крові, що досліджується попередньо розбавленої у 20 разів. Суміш витримують протягом 1 год у водяній бані (п.3.3)  при температурі 20 ?С. Паралельно у дві пробірки (п.3.15)  дозатором лабораторним (п.3.4)  вносять по 5 мл суспензії азофібрину і по 0,7 мл 0,05 М натрій-фосфатного буфера, що містить 0,15 г/л натрію хлориду (п.8.2.2).

9.3 Після закінчення інкубації плазміну з плазмою у першу пробірку з суспензією азофібрину  дозатором лабораторним (п.3.4) вносять 0,3 мл проінкубованої суміші, а в другу 0,15 мл вихідного розчину плазміну (п.8.2.3)  Обидві пробірки витримують протягом 1 год на бані водяній (п. 3.3) при температурі 37 ?С, після чого у другу пробірку  дозатором лабораторним (п.3.4) додають 0,1 мл розбавленої плазми. Обєм проб у обох пробірках доводять дистильованою водою (п.3.21) до 4 мл і фільтрують обидві розведені проби крізь вату (п 3.19) в шприці (п 3.12).

9.4 До фільтратів  дозатором лабораторним (п.3.4) додають по 0,02 мл  5 М розчину натру їдкого  (п.8.2.1). Після перемішування миттєво виникає інтенсивне забарвлення від оранжевого до червоного. Виміряють оптичну густину фільтратів  порівняно з дистильованою водою (п.3.21) на спектрофотометрі (п.3.8) при довжині хвилі 440 нм або на фотоелектрокалориметрі ФЕК-М (п. 3.10) з світлофільтром №3 (синім) при довжині оптичного шляху 1 см.

Кількість антиплазмінів у плазмі, що показана у процентах гальмування активності плазміну в перерахунку на 1 мл плазми, визначають за формулою:

                             Х= (Е2 - Е1) ?К , де

Е1 і Е2 поглинання в першій і другій пробірках;

К - розрахунковий коефіцієнт, виведений для кожної серії субстрату, який визначають при дослідженні пулу плазми здорових донорів.

Нормальний показник рівня активності антиплазмінів у плазмі, визначений при дослідженні плазми двадцяти здорових донорів, дорівнює (100?17) од/мл.

10 ОБРОБКА ТА ОФОРМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ВИМІРЮВАНЬ

10.1 За результат вимірювання приймають середнє значення (хср, %) двох паралельних вимірювань, яке розраховується за формулою:

хср=(х1 + х2)/2,

де х1, х2 значення, отримані у двох паралельних вимірюваннях.

10.2  Результати вимірювань заносяться до облікової медичної документації, затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.01 №1:

•  форма 237/о “Аналіз крові (показники системи згортання)”;
•  форма 238/о - “Аналіз крові (показники системи згортання скорочений варіант”;
•  форма 250/о “Журнал реєстрації аналізів і їх результатів”;
•  форма 262/о “Журнал обліку аналізів, зроблених в лабораторії”.

 11 КОНТРОЛЬ ПОХИБКИ ВИМІРЮВАНЬ

11.1 Визначення систематичної похибки вимірювань за даною методикою проводиться методом паралельних проб. Для цього проводять по два паралельних вимірювання 10 проб пацієнтів поточного дня.

11.2 Вимірювання  активності антиплазміну плазми крові проводять відповідно до розділу 9.

11.3 Отримані дані заносять у таблицю 3.

Таблиця 3.

11. 4 За отриманими результатами вимірювань розраховується середнє значення показників (п.10.1), середньоквадратичне відхилення (?) та коефіцієнт варіації (V). Результати розрахунків порівнюються з величинами, наведеними в таблиці 1 розділу 2.

11.5 Будують контрольну карту кумулятивних сум.

11.6 Кожного дня різницю між двома паралельними вимірюваннями проб, відмічають на карті. Результати, які попадають за межі контрольних вимірювань (2?) вказують на наявність недоліків в системі вимірювання.

11.7 Якщо отримані результати вимірів не відповідають вимогам розділу 2 та п.11.6, то виміри необхідно повторити.

11.8 Якщо результати повторного контролю незадовільні, то виконання вимірювання необхідно припинити, виявити та усунути причини, які до цього призвели.

12. ПОСИЛАННЯ НА НОРМАТИВНІ ДОКУМЕНТИ